七甲川菁荧光染料在肝细胞癌移植模型活体成像中的应用

王勤周, 张 成, 李 丽, 谭邓旭, 张彩勤, 师长宏

(1. 陕西省医疗器械质量监督检验院, 西安 712046; 2.第四军医大学实验动物中心, 西安 710032)

血液和组织对700～1 100 nm的近红外(nearinfrared, NIR)光吸收和散射水平较低，所以NIR的荧光容易透过生物组织用于活体成像[1]。与其他荧光成像相比, NIR成像技术具有深部组织穿透性、低背景荧光干扰等优点，是非侵入性肿瘤成像的有效方法，在实验和临床成像方面显示出巨大的潜力[2]。吲哚菁绿(ICG)是唯一被美国FDA批准用于临床术中导航的NIR荧光染料，但缺乏肿瘤靶向性[3]。我们实验室合成并筛选了一系列具有肿瘤靶向性的七甲川菁NIR荧光染料，包括IR-783和MHI-148， 这些化合物在胃癌和前列腺癌异种移植模型中显示出良好的肿瘤特异性[4,5]。

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种高发生率的肿瘤，需要基于影像的早期检测才能获得有效的临床治疗效果[6]。本研究中，我们通过建立HCC的裸小鼠皮下移植模型，研究七甲川菁染料MHI-148识别肿瘤的特异性、荧光强度和代谢特征，为其应用于肝癌模型活体成像提供关键的参数条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性BALB/c裸小鼠10只，6～7周龄，购自维通利华实验动物有限公司[SCXK(京)2012-0001]，饲养于第四军医大学实验动物中心的SPF级屏障环境中[SYXK(陕)2014-001]。小鼠腹腔注射氯胺酮(10 mg/kg)和赛拉嗪(3 mg/kg)的混合液麻醉，成像期间异氟醚维持麻醉。所有动物实验都获得第四军医大学动物福利伦理委员会批准(No.16013)。

1.2 试剂

人HCC细胞系Hep3B2.1-7(Hep3B)购自中国科学院上海生命科学研究院，小鼠正常肝细胞由本实验室制备。慢病毒转染Luc-GFP-Puro细胞试剂盒购自汉恒生物技术公司(上海)。绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(luc)双重标记的Hep3B细胞(Luc-GFPHep3B)由本实验室制备。MEM/EBSS培养基和胎牛血清均购自美国Hyclone/Thermo Scientific公司。七甲川菁化合物MHI-148由Cedars-Sinai医学中心的Leland W.K. Chung 教授提供[7]。

1.3 生物发光(BIL)和近红外荧光(NIRF)活体成像

使用配备有NIRF滤光片(激发/发射波长为783/840 nm)的Caliper LuminaⅡ小动物光学成像系统(美国Perkin Elmer公司)，在注射MHI-148(剂量为0.5 μmol/kg)后的多个时间点进行全身或器官特异性光学成像。计算每平方厘米肿瘤组织的荧光强度。另外每只小鼠腹腔注射D-荧光素(3 mg)后，进行体内BIL成像[8]。

1.4 HCC细胞对MHI-148的摄取

将人HCC细胞系Hep3B培养在含体积分数10%胎牛血清MEM / EBSS培养基中(质量分数1%青霉素/链霉素), 相同条件将Luc-GFP-Hep3B和正常肝细胞混合培养, 24 h后, 加入20 μmol/L的MHI-148溶液10 μL, 共培养温育30 min后用PBS洗涤3次,然后细胞继续培养。分别在培养后1 h、3 h、6 h、12 h和24 h，通过配备有75 W氙灯的NIRF显微镜(Olympus IX71，日本Olympus公司)对细胞进行NIRF染料摄取分析(配备ICG滤光片激发/发射:750～800 nm/820～860 nm)。上述所有细胞实验均设3个复孔。

1.5 MHI-148在HCC裸小鼠皮下移植模型中代谢

为建立人HCC移植模型，将2×106个Hep3B细胞注射入裸小鼠右后肢皮下，共10只。2周后可形成肉眼可见肿瘤，荷瘤小鼠腹腔注射MHI-148(0.5 μmol/kg或200 μmol/小鼠)。分别在注射后12 h、24 h和48 h, 采用小动物光学成像测量肿瘤部位和主要器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)内的NIRF强度。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 MHI-148染料在HCC细胞中的集聚

MHI-148溶液与人HCC细胞系Hep3B一起温育后, 在荧光显微镜下检测肝癌细胞对MHI-148染料摄取。结果显示在1 h时肿瘤细胞中集聚的NIR荧光最强，3 h后强度下降，并与1 h组有显著差别(P＜0.05)。在12 h和24 h时，染料处理的细胞依然保持20%的荧光信号(图1A和图1B)。

2.2 MHI-148染料对HCC细胞的特异性识别

在Luc-GFP-Hep3B和正常肝细胞共培养物中加入MHI-148染料一起孵育, 并进行荧光显微镜观察。结果显示NIRF信号仅出现在Hep3B细胞中，同时呈现NIRF红色荧光和GFP绿色荧光; 而在正常肝细胞(GFP表达为阴性)中未观察到NIRF(图2)，表明MHI-148聚集在肝癌细胞, 而不是正常肝细胞。

图1 体外培养的肝癌细胞Hep3B对MHI-148特异性吸收

图2 标记GFP的Hep3B肝癌细胞对MHI-148的特异性性识别 (×400)

2.3 MHI-148在HCC裸小鼠移植模型中器官分布

将带有luc标签的Hep3B细胞接种到裸小鼠皮下, 2周后形成肿瘤。荷瘤小鼠腹腔注射MHI-148溶液，剂量为0.5 mmol/kg。24 h后，通过NIR活体光学成像确定肿瘤位置，肿瘤区域内的单位面积(cm2)荧光强度约为8.35×109，肿瘤部位NIRF的信号与BIL信号具有较好的一致性(图3A)。

HCC皮下荷瘤鼠腹腔注射MHI-148溶液后, 在不同时间点处死小鼠, 取心、肝、脾、肺、肾和皮下瘤, 活体成像检测上述组织的NIRF强度(图3B)。结果显示, MHI-148在16 h、24 h和48 h在肿瘤组织中表现出高特异性, 在其他脏器中较少有聚集。

图3 MHI-148在肝癌细胞Hep3B移植模型中的器官分布

2.4 MHI-148在HCC皮下荷瘤小鼠体内代谢特征

HCC皮下荷瘤裸小鼠注射MHI-148后，在不同时间点测定每平方厘米肿瘤部位的NIRF强度值(tumor，T)，同时测定每平方厘米正常组织的NIR荧光强度值(background, B)。结果显示，MHI-148注射到裸小鼠后，肿瘤部位荧光强度逐渐增加，注射后6 h稳定，并在24 h达到平台(图4)。T/B值逐渐增加，并在24 h达到峰值，最大值为5.0，与10 h相比有显著差别(P＜0.05)。其后B值迅速下降, 而肿瘤部位在48 h依旧保持较强的荧光(图4)。

3 讨论

常规NIR染料缺乏肿瘤靶向性，需要用肿瘤特异性肽或抗原进行标记，这样只能识别部分肿瘤, 例如, 生物受体如表皮生长因子受体(EGFR)，人表皮生长因子受体-2(HER2)和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物受体(uPAR)已被报道[9]在某些肿瘤中很丰富, 但在其他肿瘤中较少见。同时, 化学结合常常会影响靶分子的稳定性[10]。因此, 迫切需要研究具有成像和肿瘤靶向双重作用的新型NIRF染料。

图4 MHI-148在肝癌细胞Hep3B移植模型中的代谢特征

虽然ICG成功用于肝癌的术中导航，但它对肿瘤细胞的结合缺乏特异性，常诱导正常组织产生较强荧光。此外，肝脏是ICG代谢的主要器官，常表现出非特异性聚集，这限制了ICG在肿瘤术中导航中的应用[11]。本研究表明，HCC对MHI-148的摄取具有良好的特异性，BIL和荧光成像的信号范围显示出较好的一致性。当小鼠HCC移植模型用于活体荧光成像时，选择肿瘤部位荧光强度足够高，背景值足够低，形成最大T/B值的时间，应该是荧光信号采集的最佳时机。本研究中当MHI-148注射入HCC荷瘤小鼠体内，检测显示荧光信号主要集中在肿瘤部位，其他器官NIRF信号较弱, 在注射后12 h至48 h显示良好的肿瘤特异性, 20 h荧光强度最高，背景值较低，形成最大T/B值，因此，MHI-148用于肝癌荷瘤小鼠活体成像的检测时间应选择注射后24 h，这与之前报道[5]一致。本研究体外实验显示，HCC细胞中的NIRF强度在24 h时已降至20%，但在小鼠肿瘤部位表达仍然较强，二者代谢时间不一致, 提示体内代谢缓慢, 与体外存在一定的差别。文献报道[12], ICG在小鼠肿瘤移植模型中注射6～10 h, 肿瘤部位荧光强度达到峰值, 成像剂量为10 μmol/kg。本研究中使用的MHI-148剂量仅为0.5 μmol/kg(10 nmol/小鼠), 约为ICG的1/20，但单位面积的荧光强度达到109，显示出良好的肿瘤靶向性。甚至在给药后48 h，肿瘤部位的NIR荧光强度依旧可以达到109(图4)，提示该化合物具有强的光量子产率。

理想的荧光探针应具有选择性积累, 高光稳定性和量子产率。在本研究中, 七甲川菁化合物显示出NIRF和肿瘤靶向的双重特征, 微小剂量(0.5 μmol/kg)就可在肿瘤部位诱发特异性荧光，持续24～48 h，活体成像最佳时间为注射后24 h，这为肝癌的临床成像提供了良好的NIRF探针。