慢性疲劳综合征大鼠模型相关指标观测

饶子亮, 冯学轩, 黄小红, 黎莉斯, 李金凤, 邝少松, 王 刚

(广东省医学实验动物中心, 佛山 528248)

随着当代社会竞争增强和生活节奏加快，慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS，中医称为虚劳症)已成为21世纪亚健康的主要表现形式之一[1]，发病率高，持续时间长，对人们身心健康、生产和生活质量等方面均带来负面影响，并很容易由临床前期转入疾病状态。但CFS相关的机制尚不明确，利用动物模型研究该病产生机制对临床干预与治疗具有重要意义。

CFS缺乏特异性诊断标准和特别的检测手段，其诊断主要依靠临床表现[2]。因此通过实验方法制备动物模型，进行客观指标测定已经成为CFS研究的重要方法。目前，CFS动物模型多采用游泳、跑台、束缚、慢性应激等因素进行造模。这些考虑了体力型、心理应激型慢性疲劳，与非体力劳动者发病的多因性仍有较大差距，随着现代生活节奏的加快，越来越多人呈现的是社会应激型疲劳。

本研究采用拥挤、噪音和睡眠紊乱干预的方法，模拟城市人口激增、拥堵、噪音和睡眠不规律，从而使动物模型更接近于现代人的生活方式，便于更好研究CFS的机制和探索有效的临床干预技术。本研究通过动态检测该模型的血液、生化、免疫等客观性指标，评估拥挤、噪音和睡眠紊乱对动物健康的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养条件

SPF级雄性SD大鼠40只, 200～240 g, 由广东省医学实验动物中心提供[SCXK(粤)2013-0002]。

大鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物实验室内[SYXK(粤)2013-0002]，室内保持20～26 ℃，相对湿度40 %～70 %，自由饮食，SPF级饲料由广东省医学实验动物中心生产。实验方案经广东省医学实验动物中心实验动物伦理委员会审查通过[B201708-21]。

1.2 主要仪器

JEA3001电子天平: 精度0.1 g, 上海浦春计量仪器有限公司。Testo1350A噪音计, 泰仕电子工业股份有限公司。BC-5000全自动血液细胞分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。7020全自动生化分析仪，日本株式会社日立高新技术公司。

1.3 动物分组

动物检疫结束后按体质量随机分为正常对照组、低度拥挤组、中度拥挤组、高度拥挤组，10只/组，共4组。

1.4 造模

在前期研究的基础上[3], 正常对照组按5只/笼正常饲养于大饲养盒内(54.5 cm×39.5 cm×20.0 cm),低度拥挤组按3～4只/笼饲养于小饲养盒内(29.4 cm×19.0 cm×12.5 cm)，中度拥挤组按10只/笼饲养于中饲养盒内(38.0 cm×32.5 cm×18 cm)，高度拥挤组按5只/笼饲养于小饲养盒内(29.4 cm×19.0 cm×12.5 cm)。每日拥挤6 h同时播放90 dB噪音，拥挤开始时间不固定，拥挤结束时将各组大鼠按5只/笼放回大盒正常饲养。除正常对照组外，其余各组每周颠倒光暗周期(12 h/12 h)。每周轮换鼠笼位置，保证大鼠收听噪音和接收光照强度的一致性。造模持续64 d，并进行强迫游泳。

1.5 观测指标

1.5.1 一般情况观察 每日观察记录大鼠的精神状态、皮毛色泽及耳尾颜色等。每周于动物的明期录像30 min，观察无人状态下的大鼠行为表现。在前期研究的基础上[3]，分别于造模后1 d、36 d和64 d按照表1对三种状态进行评分，计算总分值。

表1 慢性疲劳大鼠表现半定量评分表

1.5.2 体质量 每周测量体质量一次。

1.5.3 摄食量 分别于造模后1 d、36 d、64 d测定动物24 h摄食量。

1.5.4 强迫游泳不动时间 试验期末(64 d), 强制大鼠在室温(22±3)℃的水池(直径160 cm, 水深40 cm)中游泳，游泳持续6 min[4]。大鼠在最初体力充沛的活动后就会出现一种典型不动姿势，测定在这6 min内大鼠总共不动时间。不动标准是根据大鼠停止任何四肢挣扎运动, 使其头部浮出水面来判断。

1.5.5 血液指标 于造模后35 d，49 d及试验期末强迫游泳后，动物按1.5 mL/kg体质量腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后，眼眶静脉窦采血，EDTA抗凝测血常规，同时采促凝血约1 mL离心取上清，-80 ℃保存用于测定免疫球蛋白G(IgG)及血乳酸(BLA)的含量。

1.6 数据处理

采用SPSS 21.0统计软件进行数据整理，用x-± s表示。强迫游泳不动时间采用单因素方差分析,慢性疲劳半定量评分采用秩和检验, 其他数据采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及半定量评分

各拥挤组大鼠自主活动减少、精神萎靡、皮肤松弛、毛发变黄、耳尾颜色淡红少泽，评分值升高。通过录像观察，拥挤及噪声刺激后，各拥挤组短时间内表现较正常对照组躁动并喜打闹; 取消刺激后，各拥挤组神情稍显困倦、反应性及抵抗性有所下降，并较正常对照组安静。与正常对照组比较，低、中、高度拥挤组36 d、64 d评分显著升高(P＜0.05)(表2)。

表2 各组大鼠慢性疲劳半定量评分的比较

2.2 体质量

与正常对照组比较, 从22 d开始中度拥挤组、高度拥挤组体质量均显著下降(P＜0.01)。与低度拥挤组比较，中度拥挤组除36 d外，15～64 d体质量显著下降(P＜0.05)、高度拥挤组15d～64 d体质量显著下降(P＜0.05)。中度拥挤组与高度拥挤组体质量比较，差异无统计学意义(表3)。

2.3 摄食量

与正常对照组比较, 除了低度拥挤组64 d摄食量外, 各拥挤组摄食量显著下降(P＜0.05)。与低度拥挤组比较, 中、高度拥挤组36 d摄食量显著上升(P＜0.05)，中、高度拥挤组64 d摄食量显著下降(P＜0.05)(表4)。

2.4 强迫游泳不动时间

与正常对照组比较，中度拥挤组强迫游泳不动时间显著升高(P＜0.05)(表5)。

2.5 血常规

与正常对照组比较, 中度拥挤组49 d、高度拥挤组35 d白细胞数(WBC)明显减少(P＜0.05); 低、中、高度拥挤组35 d淋巴细胞数(Lymph)明显减少(P＜0.05); 中度拥挤组35 d、49 d、64 d红细胞数(RBC)明显减少(P＜0.05), 低度拥挤组35 d、64 d的RBC数明显减少(P＜0.05)。低、中度拥挤组35 d、64 d血红蛋白(HGB)含量明显减少(P＜0.05), 高度拥挤组64 d的HGB含量明显减少(P＜0.05); 低、中度拥挤组35 d、64 d红细胞比容(HCT)明显下降(P＜0.05),高度拥挤组64 d的HCT明显下降(P＜0.05)(表6)。

2.6 血乳酸和IgG

与正常对照组比较，高度拥挤组64 d 血乳酸明显上升(P＜0.05)。与正常对照组比较，低、中度拥挤组49 d的 IgG明显上升(P＜0.05)，高度拥挤组35 d的 IgG明显上升(P＜0.05)(表7)。

表3 各组大鼠体质量的比较

表4 各组大鼠平均每日摄食量比较 g

表5 各组大鼠强迫游泳不动时间的比较

3 讨论

现有研究显示, 职业不同，CFS的检出率不同,从事脑力劳动的教师、公务员、医务工作者[5,6]等检出率较高: 全人群CFS检出率为3.28%～8.4%[7]，公务员CFS检出率为6.07 %[8]，教师CFS检出率为 10.0%～12.9%[9,10]。慢性疲劳在大学生中也有广泛存在(19.91%), 其中可明确诊断为CFS的大学生占总数的1.3%[11]。CFS伴焦虑、抑郁状态[12]的发生是多因素作用的结果，情绪状态可能与睡眠质量和脑力疲劳相关性很高[13]。医学界日益重视心理因素在疾病的发生、发展中扮演的重要角色, 睡眠障碍、焦虑、抑郁等精神、心理因素与各种疾病相互影响, 互为因果[14,15]。CFS模型主要有单因素模型和复合因素模型两类: 单因素模型主要包括强迫游泳、电击、悬尾等应激源建立躯体应激模型, 束缚等应激源建立心理应激模型, 社会隔离(孤养)等应激源建立社会性应激模型; 复合因素模型主要为慢性轻度不可预见性应激模型, 应激源包括不定期的禁食、禁水、昼夜颠倒、夹尾、冰水游泳等[16-21]。慢性应激时可影响情绪变化(与海马损伤密切相关)[22],同时也会使机体免疫力变化。多种慢性应激因素引起的慢性疲劳模型大鼠在症状和实验室指标上与人类CFS的表现更接近[23]。

表6 各组大鼠血常规的比较

续表6

表7 各组大鼠血乳酸及IgG的比较

束缚是一种经典的非损伤性刺激造模方法，笔者在束缚的基础上改进成拥挤，将大鼠群养在小的饲养盒中，因为拥挤无法行动也产生了固定的效果，操作方便。本研究综合运用不定期的拥挤、噪音和昼夜颠倒等不同的应激因子长期温和刺激大鼠，使其不可预料刺激的发生，与人类慢性、低水平的应激源促进疾病发生、加速疾病发展的机制更接近，模拟城市人口激增、拥堵和睡眠不规律，接近于现代人的生活方式。本研究通过设置不同的生活空间大小(小盒或中盒)来观察拥挤对慢性疲劳的影响; 同时给于每周昼夜颠倒及噪音刺激影响大鼠的正常休息, 导致睡眠节律紊乱。各拥挤组大鼠慢性疲劳半定量评分从36 d显著增加、64 d评分更高，低、中、高度拥挤组评分按照拥挤程度有升高的趋势。中、高度拥挤组大鼠体质量从22 d开始显著下降，36 d中、高度拥挤组体质量显著低于低度拥挤组。中、高度拥挤组大鼠日摄食量从36 d开始显著降低，64 d 中、高度拥挤组日摄食量低于低度拥挤组。各拥挤组35 d Lymph明显减少，高度拥挤组35 d WBC明显减少，低、中度拥挤组35 d RBC、HGB含量、HCT明显下降。拥挤、噪音和睡眠紊乱复合刺激因素会导致大鼠自主活动减少、精神萎靡、皮肤松弛、毛发变黄、耳尾颜色淡红少泽，慢性疲劳评分值升高，出现典型的疲劳症状。WBC、RBC、HGB全面下降，提示免疫力低下。随着造模时间的增加，慢性疲劳半定量评分增加，CFS症状更加明显。拥挤程度越高、生活空间越少导致CFS表现越明显。本研究采用拥挤、噪音和睡眠紊乱构建CFS 动物模型，探讨了拥挤、噪音和睡眠紊乱对大鼠健康特别是血液学指标的影响，体现了慢性疲劳的社会病因，提示临床上关注交通拥挤、生活空间、工作空间等与CFS的相关性。本文虽然观测了慢性疲劳半定量评分、体质量、摄食量和血液学指标，但行为学指标、免疫内分泌指标和具体机制机理尚需进一步研究探讨。