芍药苷和芍药内酯苷的抗抑郁作用与NO/cGMP信号转导通路的相关性

吴丽 王丽丽 李伟 侯燕 王景霞 张建军

摘要目的：比較赤芍、白芍及其有效成分芍药苷、芍药内酯苷对小鼠的抗抑郁作用及其与NO/cGMP信号转导通路的相关性。方法：选取小鼠悬尾实验模型，给予赤芍水提物、白芍水提物，记录小鼠悬尾不动时间。采用相同实验方法给予小鼠芍药苷和芍药内酯苷，并检测小鼠大脑皮质及海马组织中NO/cGMP通路相关指标。结果：与模型组比较，2 g/kg赤芍和2 g/kg、1 g/kg白芍组小鼠悬尾不动时间减少，差异有统计学意义（P<005）。与2 g/kg赤芍同剂量组比较，白芍的小鼠悬尾不动时间减少，差异有统计学意义（P<005）。与模型组比较，20 mg/kg芍药苷组、20 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠悬尾不动时间及NO、cGMP含量明显减少，差异有统计学意义（P<005）；且与10 mg/kg芍药苷同剂量组比较，芍药内酯苷组的小鼠悬尾不动时间及NO含量明显减少，差异有统计学意义（P<005）。与模型组比较，20 mg/kg芍药苷组及20 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠nNOS、GluR1mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P<005）。结论：白芍具有抗抑郁作用，芍药苷和芍药内酯苷是白芍抗抑郁作用的物质基础；与白芍比较，赤芍的抗抑郁作用较弱，与其主要含有抗抑郁作用较弱的芍药苷，而不含抗抑郁作用较强的芍药内酯苷有关。

关键词赤芍；白芍；芍药苷；芍药内酯苷；悬尾实验；抗抑郁；NO；cGMP

Correlation Study on Antidepressant Effect of Paeoniflorin and Albiflorin and NO/cGMP Signal Transduction Pathway

Wu Li1， Wang Lili2， Li Wei1， Hou Yan1， Wang Jingxia1， Zhang Jianjun1

（1 College of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2 Department of Pharmacy， Beijing Jingmei Group General Hospital， Beijing 102300， China）

AbstractObjective：To investigate the correlation between antidepressant effects of paeoniflorin and albiflorin on mice and NO/cGMP signal transduction pathway. Methods：Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba was intragastric administered to the mice to establish the mice model of antidepressant with tail suspension test （TST）， and the time of immobility was recorded. The same methods were used to study paeoniflorin and albiflorin. And the NO/cGMP pathway related indicators of cerebral cortex and hippocampus were detected. Results：Compared with model group， 2 g/kg Radix Paeoniae Rubra and 2 g/kg， 1 g/kg Radix Paeoniae Alba can reduce the immobility time of tail suspension （P<005， P<0001， P<005）. Compared with the same dose of Radix Paeoniae Rubra， the TST immobility time of 2 g/kg Radix Paeoniae Alba were obviously lower （P<005）. Compared with model group， 20 mg/kg paeoniflorin， 20 mg/kg albiflorin can reduce the immobility time of tail suspension and the content of NO， cGMP （P<005， P<0001）； Compared with the same dose of paeoniflorin， the immobility time of tail suspension and the content of NO of 10 mg/kg albiflorin were obviously lower （P<005）. Compared with model group， 20 mg/kg paeoniflorin and 20 mg/kg albiflorin can reduce the mRNA expression of nNOS， GluR1 （P<005， P<001， P<005）. Conclusion：Radix Paeoniae Alba has antidepressant effect， and paeoniflorin and albiflorin are the material basis of the antidepressant effect of Radix Paeoniae Alba； however， in the administration range of this experiment， the antidepressant effect of Radix Paeoniae Rubra is not obvious compared with that of Radix Paeoniae Alba， which may be related with it mainly containing paeoniflorin which antidepressant effect is weaker， but not containing albiflorin which antidepressant effect is stronger.

Key WordsRadix Paeoniae Rubra； Radix Paeoniae Alba； Paeoniflorin； Albiflorin； Tail suspension test； Antidepressant； NO； cGMP

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.038

芍药首载于《神农本草经》，列为中品药；直至梁朝陶弘景《本草经集注》将其区分为赤芍、白芍2种。研究表明，两者及两者主要成分白芍总苷、赤芍总苷均具有抗抑郁作用[12]。抑郁症属中医“郁证”“虚劳”范畴，其发病多始于肝，及于心神，并与脑相关[34]。赤芍、白芍均归肝经，治疗肝郁胁痛等病症[5]，广泛用于郁症等疾病的防治之中[1]。赤芍、白芍主要化学成分均为单萜类化合物，芍药苷为两者共有成分，而芍药内酯苷为白芍的特征性成分[6]；且两者均具有抗抑郁作用[78]。我们采用小鼠悬尾实验模型，给予赤芍水提物、白芍水提物、芍药苷、芍药内酯苷，记录小鼠悬尾不动时间，并检测大脑皮质及海马组织中NO/cGMP通路相关指标，研究赤芍、白芍以及芍药苷、芍药内酯苷的抗抑郁作用及作用机制。

1材料与方法

11材料

111动物SPF級昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g，由维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证编号：SCXK（京）20150001。

112药物1）受试药物：赤芍水提物、白芍水提物、芍药苷、芍药内酯苷。赤芍饮片购自内蒙古，白芍饮片购自安徽亳州。经北京中医药大学中医学院科研实验中心鉴定合格，并由北京中医药大学中医学院中药学实验室制备。赤芍水提物按常规方法制备，计算出膏率为375%，经高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定，含芍药苷为826%，芍药内酯苷为0。白芍水提物按常规方法制备，计算出膏率为275%；经HPLC测定，含芍药苷为772%，芍药内酯苷为43%。2）芍药苷和芍药内酯苷：按专利技术方法自制，纯度均高于96%。3）阳性药：盐酸氟西汀胶囊，南京新百药业有限公司，批号1503031。

113试剂与仪器一氧化氮测试盒，环磷酸鸟苷放免试剂盒，购自北京华英生物技术研究所。Trizol试剂（RNA提取剂），购自Invitrogen公司。MMLV逆转录酶，购自Promega公司。SYBER Green I实时荧光定量PCR试剂盒，购自Roche公司。所测指标相应引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。铁架台，剪刀，胶布，JZ型100 g张力换能器（高碑店市新航机电设备有限公司）；Medlab生物信号采集系统（南京易美科技有限公司）；Medlab生物软件。日本日立7160全自动生化仪，r911全自动放免计数仪，LightCycler 20实时荧光定量PCR仪（Roche诊断公司）。

12方法

121分组与模型制备取正常小鼠70只，按体重随机均分成7组，即空白组，模型组，盐酸氟西汀组，2 g/kg、1 g/kg赤芍水提物组，2 g/kg、1 g/kg白芍水提物组，适应性饲养5 d（室温20～22 ℃，相对湿度65%～70%，12 h为昼夜周期环境，自由饮食进水）。

122给药方法

各给药组均灌胃给予相应药物，按每10 g体重灌胃02 mL给药，1次/d。空白组和模型组给予等剂量蒸馏水，盐酸氟西汀组给予盐酸氟西汀溶液35 mg/kg。

实验动物分组同上。给药方法为腹腔注射给药，注射剂量01 mL/10 g，其中芍药苷组的剂量分别为20 mg/kg、10 mg/kg，芍药内酯苷组的剂量分别为20 mg/kg、10 mg/kg。

123检测指标与方法以上各组均连续给药3 d，末次给药后1 h，除空白组外，将其余小鼠尾端（距离尾尖约2 cm处）用胶布固定在100 g张力换能器的连线上，使其呈倒悬状态，其头部距离实验台约15 cm，每次测试2只小鼠，且相互之间用纸板隔开。换能器连接至Medlab生物信号采集处理系统，适应2 min后，记录4 min之内不动状态，并将其换算成小鼠悬尾不动时间（s）。芍药苷和芍药内酯苷对小鼠悬尾实验的影响的小鼠在记录小鼠悬尾不动时间后，脱颈椎处死，剥离大脑，取大脑皮质和海马，置于冻存管中，保存于-80 ℃冰箱中，备用。

采用格里斯法，按照NO试剂盒说明测定小鼠大脑皮质中NO含量；采用放射免疫法，按cGMP试剂盒说明测定各组小鼠大脑皮质中cGMP含量。

取各组小鼠海马组织100 mg，在研磨器中研磨裂解，并离心。海马组织总RNA的提取按照Trizol试剂盒说明进行，并经紫外分光光度计检测样本RNA含量和纯度。根据总RNA逆转录合成cDNA。釆用SYBR Green I荧光染料技术，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应条件为94 ℃ 10 min、94 ℃ 10 s、X ℃（基因相应退火温度）10 s、72 ℃ 10 s，45个循环。反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物是否符合原设计片段长度。采用Light Cycler系统进行PCR反应及数据采集。实时荧光定量聚合酶链式反应法（RTqPCR）测定小鼠海马组织nNOS、sGCα2、GluR1mRNA基因表达水平。引物设计见表1。

13统计学方法采用SPSS 200统计软件对实验数据进行分析，数据结果以均值±标准差（±s）表示。先对数据进行正态性检验和方差齐性检验，数据符合正态分布，方差齐性，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。以P<005为差异有统计学意义。

2结果

21赤芍、白芍对小鼠悬尾不动时间的影响与模型组比较，氟西汀组的小鼠悬尾不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<005）；2 g/kg赤芍水提物组和2 g/kg白芍水提物组小鼠悬尾不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<005）；1 g/kg白芍水提物组小鼠悬尾不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<005）。与2 g/kg赤芍同剂量组比较，白芍水提物组的小鼠悬尾不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<005）。见表2。

22芍药苷、芍药内酯苷对小鼠悬尾不动时间及NO/cGMP的影响与模型组比较，氟西汀组、20 mg/kg芍药苷组及20 mg/kg、10 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠悬尾不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<005）；且与10 mg/kg芍药苷同剂量组比较，芍药内酯苷组的小鼠悬尾不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<005）。与模型组比较，空白组、氟西汀组、20 mg/kg芍药苷组及20 mg/kg、10 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠NO含量明显减少，差异有统计学意义（P<005）；且与10 mg/kg芍药苷同剂量组比较，芍药内酯苷组的NO含量明显减少，差异有统计学意义（P<005）。与模型组比较，空白组、氟西汀组、20 mg/kg芍药苷组及20 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠cGMP含量明显减少，差异有统计学意义（P<005）。见表3。

23芍药苷、芍药内酯苷对小鼠nNOS、sGCα2、GluR1mRNA表达的影响与模型组比较，空白组nNOS、GluR1mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<005）；氟西汀组、20 mg/kg芍药苷组及20 mg/kg、10 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠nNOSmRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P<005）；氟西汀组、20 mg/kg芍藥苷组及20 mg/kg芍药内酯苷组的小鼠GluR1mRNA表达明显减少，差异有统计学意义（P<005）。见表4。

3讨论

抑郁症是一种以显著持久的情绪低落、悲观自责为主要特征的常见精神障碍，严重者可出现自杀念头和行为，且具有高发病、高复发、高医疗成本的特点。目前临床上抗抑郁药的疗效虽值得肯定，但普遍存在药效弱、起效慢、作用时间短、不良反应明显等弊病；而就抑郁症状的复杂多变、患者的依从性及药物的不良反应而言，中医药对于抑郁症的治疗显示出独特的优势，且逐渐成为研究的热点[910]。

中医虽无抑郁症这一病名，根据其发病特点多将其归属于郁证、虚劳等范畴。结合药理实验研究与临床应用，白芍和赤芍均可用于治疗抑郁症[1]。

白芍归肝、脾经，具有养血柔肝、敛阴止汗之功效，与柴胡配伍疏肝解郁、调畅情志组成四逆散、逍遥丸等临床常用抗抑郁方剂。赤芍归肝经，清热凉血、化瘀止痛，有研究表明其与淫羊藿、石菖蒲组成药对具有良好的抗抑郁作用[1112]。

本实验采用行为绝望模型中的小鼠悬尾模型进行研究，悬尾小鼠为克服不正常体位首先产生以逃避为导向的挣扎运动，在经过努力仍不能摆脱后而出现间歇性不动，出现“行为绝望”，产生与人类抑郁症相似的生理生化状态[13]。氟西汀是临床常用治疗抑郁症等精神疾患的药物，前期研究表明，35 mg/kg盐酸氟西汀在小鼠悬尾模型中抗抑郁作用明显[7]。1 g/kg的赤芍与白芍给药剂量相当于成人每日临床用量的6 g，并根据两者芍药苷、芍药内酯苷的含量，结合预实验结果确定芍药苷、芍药内酯苷的剂量。实验结果显示，白芍具有抗抑郁作用，芍药苷和芍药内酯苷是白芍抗抑郁作用的物质基础；但是，在本实验给药范围内，与白芍比较，赤芍的抗抑郁作用较弱，与其主要含有抗抑郁作用较弱的芍药苷，而不含抗抑郁作用较强的芍药内酯苷有关。

NO/cGMP通路为近年来备受关注的抑郁症发病机制之一[1415]，NO为新发现神经系统重要的神经递质，一方面可直接作用于神经元参与信息传递，另一方面可通过催化生成cGMP，作为第二信使发挥生物效应，参与多种生物功能的调控。过量的NO则可引起神经毒性，通过增加cGMP的合成而在抑郁状态中发挥重要作用[16]。应激状态下，谷氨酸（Glu）与其受体（GluR）结合，引起细胞膜的去极化和Ca2+的内流，从而激活一氧化氮合酶（NOS）催化NO的生成，NO激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），从而使cGMP的合成增加[17]。本实验研究表明，芍药苷、芍药内酯苷的可通过降低悬尾小鼠大脑皮质中NO、cGMP水平，降低神经毒性，减少神经元的萎缩及坏死，从而达到抗抑郁作用；进一步研究表明，芍药苷、芍药内酯苷可通过降低nNOS、GluR1mRNA的表达而下调NO/cGMP通路。

本研究对比研究了赤芍、白芍及其有效成分芍药苷、芍药内酯苷对小鼠悬尾模型的抗抑郁作用，发现赤芍、白芍及芍药苷、芍药内酯苷均具有抗抑郁作用，且治疗作用的强弱与剂量呈一定的量效关系，芍药内酯苷对该模型的抗抑郁作用优于芍药苷。故推测芍药苷是赤芍与白芍抗抑郁作用的共同有效成分，而芍药内酯苷是白芍抗抑郁作用优于赤芍的物质基础之一，可作为白芍在抗抑郁作用上区别于赤芍的特征性有效成分；芍药苷和芍药内酯苷抗抑郁作用的机制可能与其下调NO/cGMP通路有关。

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（2017-08-15收稿责任编辑：芮莉莉）