培元解郁方对急性糖皮质激素诱导SD大鼠的抗抑郁作用及TRYKYN代谢途径的调节

杨桃　张静　李丽娜

摘要目的：研究培元解郁方的抗抑郁作用以及對色氨酸（TRY）犬尿氨酸（KYN）代谢的调节机制。方法：建立氢化可的松大鼠抑郁模型，以蔗糖消耗反映大鼠的抑郁状态，采用高效液相质谱联用（HPLCMS/MS）技术检测脑组织KYN、TRY、喹啉酸（QUIN）、犬尿烯酸（KA）含量，实时荧光定量PCR技术测定肝组织中色氨酸2，3双加氧酶（TDO）mRNA表达水平和脑组织海马中吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）、5HT1A的mRNA表达。结果：造模21 d后，大鼠对蔗糖的偏好降低，KYN/TRY比值升高，QUIN含量升高，KA含量降低，TDO mRNA的表达水平增加，5HT1A mRNA的表达水平降低，差异有统计学意义（P<005）。各给药组能提高大鼠对蔗糖的偏好，差异有统计学意义（P<005）。各给药组均能显著降低KYN/TRY比值，差异有统计学意义（P<005），培元解郁方中剂量组和天丝饮组能显著提高KA的含量，降低QUIN的含量，差异有统计学意义（P<005）。天丝饮能明显降低肝脏中TDO和海马中IDO mRNA的表达，差异有统计学意义（P<005）。四逆散和培元解郁方中、高剂量能够增加海马中5HT1A mRNA的表达，差异有统计学意义（P<005）。结论：天丝饮、四逆散和培元解郁方均有抗抑郁药样作用，机制与降低TRYKYN代谢的关键酶mRNA表达，降低神经毒性代谢产物和增加神经保护性代谢产物，从而提高神经元保护作用，以及增加5HT1A的mRNA表达有关。

关键词培元解郁方；抗抑郁；色氨酸犬尿氨酸代谢途径

Antidepressant Effect of Peiyuan Jieyu Decoction and Its Regulation on TRYKYN Metabolic Pathway on Acute glucocorticoid on SD rats

Yang Tao1，Zhang Jing1，Li Lina2，Lu Yi2，Wang Shuyan2，Huang Xiang2，Zhang Bo1，Chang Hongsheng1

（1 School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China； 2 School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

AbstractObjective：To study the antidepressant effects of Peiyuan Jieyu Decoction and the regulatory mechanism of the tryptophankynurenine （TRYKYN） metabolic pathway.Methods：The rat model of depression induced by intraperitoneal injection hydrocortisone was built.The symptoms of depression were observed by sucrose preference experiment.The contents of tryptophane，kynurenine，kynurenic acid and quinaldinic acid in brain tissue were detected by HPLCMS/MS technique.The mRNA expression levels of TDO in liver tissue，IDO and 5HT1A in brain tissue were detected by using realtime PCR.Results：After 21 days′ acute stress，the preference in sucrose was reduced.The ratio of KYN/TRY and the content of QUIN were increased.The content of KA was decreased.The expression of TDO mRNA increased and the expression of 5HT1A mRNA decreased （P<005）.The Fluoxetine group，Tiansi decoction group，Sini decoction group，high dose and middle dose of Peiyuan Jieyu decoction group could improve the preference in sucrose preference experiment （P<005）.Each treatment group could obviously reduce the ratio of KYN/TRY （P<005）.Tiansi decoction and middle dose of Peiyuan Jieyu decoction could significantly improve the content of KA，and decrease the content of QUIN P<005）.Tiansi decoction could obviously decrease the expression of TDO mRNA in liver and the expression of IDO mRNA in hippocampus （P<005）.Sini decoction，middle dose and high dose of Peiyuan Jieyu decoction could increase the expression of 5HT1A mRNA in hippocampus （P<005）.Conclusion：Traditional Chinese medicine groups have antidepressant effects.Its mechanism may be connected with reducing the expression of the key enzyme mRNA in TRYKYN metabolic pathway，improving the neuron protective effect by reducing neurotoxic metabolites and increasing neuroprotective metabolites，and increasing the expression of 5HT1A.

Key WordsPeiyuan Jieyu Decoction； Antidepression； TRYKYN

中图分类号：R7816+4；R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.036

四逆散来源于张仲景的《伤寒论》，是疏肝解郁的祖方[1]，具有显著的抗抑郁作用[2]。天丝饮来源于《辨证录》，有温补肾元、安定神志之功效，所含巴戟天寡糖具有较好的抗抑郁作用[3]。本研究采用的培元解郁方即四逆散和天丝饮合方。我们采用腹腔注射氢化可的松诱导的大鼠抑郁模型，对四逆散、天丝饮和培元解郁方的抗抑郁作用进行了观察，并着重就其TRYKYN代谢调节，及相关酶TDO、IDO mRNA表达水平和5HT1A mRNA表达水平影响，进行了深入研究。

1材料与方法

11材料

111动物雄性SD大鼠56只，体重250～280 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号：SCXK（京）20110004，常规实验室饲养，自由饮食。

112药品盐酸氟西汀胶囊（上海信谊九福药业有限公司生产，生产批号：20140302A），氢化可的松（H0533，TCI）。制巴戟天配方颗粒（批号：15001781）、北柴胡配方颗粒（批号：13002303）、炙甘草配方颗粒（批号：13002752）、白芍配方颗粒（批号：13002773）、盐菟丝子配方颗粒（批号：15004252）、麸炒枳实配方颗粒（批号：120601），上述药材均由北京康仁堂药业有限公司提供。

113试剂与仪器犬尿氨酸（SigmaAldrich）、喹啉酸（Alfa Aesar）、犬尿喹啉酸（SigmaAldrich）、色氨酸（Aladdin）、已腈、甲醇等其他常规试剂均购于Fisher公司。TRIZOL REAGENT（Invitrogen），HiFiMMLV cDNA第一链合成试剂盒和SYBR Green PCR Mixture试剂盒均购自于Cwbio公司。质谱仪（美国，ABI公司，型号：3200QTRAP），荧光定量PCR仪（美国，CFX96）。

12方法

121分组与模型制备将大鼠用随机分组法分为7组：空白组、模型组、氟西汀组、天丝饮组、四逆散组、培元解郁方中剂量组和培元解郁方高剂量组，每组8只。氢化可的松（02%DMSO和02%Tween 80生理盐水溶解）40 mg/kg腹腔注射，1次/d，连续21 d建造模型。

122给药方法天丝饮的给药量045 g/kg，四逆散的给药量042 g/kg，培元解郁方中剂量给药量087 g/kg，培元解郁方高剂量给药量174 g/kg，氟西汀给药量2 mg/kg，空白组和模型组给予同等剂量的蒸馏水，灌胃给药。分别在第7天、14天、21天进行行为学测试，末次试验后取材，进行相关指标检测。

123检测指标与方法

1231蔗糖偏好测试12 h禁食禁水后，将大鼠单笼饲养，每笼放2个相同的水瓶，一只瓶盛有1%的糖水，另一瓶装自来水。记录3 h内大鼠饮用糖水和自来水的量，计算蔗糖水偏嗜度。

1232TRY、KYN、KA、QUIN含量测定大鼠腹主动脉取血，凝血后4 ℃、2 500 r/min离心15 min，吸取上清100 uL，-20 ℃冻存，HPLCMS/MS测定KYN、KA、TRY、QUIN的含量。以血清中TRY/KYN比值来表示TDO活性，KYN/KA比值来反映神经保护作用，QUIN则反映神经毒性作用。液相检测条件[4]：SLab HPC18色谱柱（150 mm×46 mm，5 μm），流动相由水（A）乙腈（B）组成，进样体积为20 μL，柱温为30 ℃，流速为08 mL/min。采用梯度洗脱：0～1 min，（95%B）；1～8 min，（95%～40%B）；8～81 min，（40%～0%B）；81～10 min，（0%B）；10～101 min，（0%～95%B）；101～15 min（95%B）。质谱检测条件：扫描方式用MRM多反应监测；离子源为+ESI电喷雾离子源，正离子方式；雾化温度500 ℃；射入电压10 V；喷雾电压+5 500 V；碰撞室射出电压20 V；GS1：55 psi（雾化气）；CAD：Medium（碰撞气）；GS2：60 psi（辅助气）；CUR：20 psi（气帘气）。

1233肝组织TDO mRNA含量测定将新鲜肝组织放到液氮速冻，用一步法提取肝组织的总RNA，吸取1 μL RNA，1%的琼脂糖凝胶进行电泳，后用试剂盒按说明书进行反转录，使用荧光定量PCR法测定其含量，用SYBR PCR Mixture进行扩增。目的基因引物序列：TDO F为GGCTATTATTATCTGCGCTCAACTG，TDO R为AACCAGGTACGATGAGAGGTTAAA，扩增产物大小：144bp，最后用2-△△ct法对实验数据进行分析。

1234海马IDO、5HT1A mRNA含量测定方法同1233。目的基因引物序列：IDO F为GACCCGAAAGCACTGGAGA，IDO R为TGCCCTTCCAACCAGACAA，扩增产物大小：120bp；5HT1A F为CTGCCCATGGCTGCTCTGTA，5HT1A R为CATCCAGGGCGATAAACAGGTC，扩增产物大小：132bp，最后用2-△△ct法对实验数据进行分析。内参的引物

13统计学方法采用SPSS 170统计软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（±s）来表示。多个样本采用单因素方差分析进行组间数据比较，如方差不齐则采用Dunnett′ s T3法，如方差齐则用LSD法，以P<005為差异有统计学意义。

2结果

21蔗糖偏好实验的结果从第21天开始模型组的蔗糖偏好明显低于正常组，差异有统计学意义（P<005）；各给药组均能提高大鼠对蔗糖的偏好，差异有统计学意义（P<005），天丝饮给药14 d即出现显著作用，差异有统计学意义（P<005）。见表1。

22对TRYKYN代谢产物的影响模型组与空白组比较，KYN/TRY比值升高、QUIN含量增加，KA含量减少，且差异有统计学意义（P<005）。与模型组比较，各个给药组的KYN/TRY比值明显降低，差异有统计学意义（P<005）；培元解郁方中剂量和天丝饮能升高KA含量，降低QUIN含量，且差异有统计学意义（P<005）。见表2。

23对肝组织TDO mRNA表达的影响与模型组比较，天丝饮可以降低TDO mRNA的表达，差异有统计学意义（P<005）。见表3。

24对海马中IDO mRNA表达的影响与模型组比较，氟西汀和天丝饮能够降低海马中IDO mRNA的表达，差异有统计学意义（P<005）。见表4。

25对海马中5HT1A mRNA表达的影响与模型组比较，四逆散和培元解郁方中、高剂量能够增加海马中5HT1A mRNA的表达，差异有统计学意义（P<005）。见表5。

3讨论

糖皮质激素注射抑郁模型是较为常用的抑郁症动物模型[56]。本研究中，模型组糖水偏好显著降低，并伴有TRY代谢异常，阳性药氟西汀能通过调节TRY代谢，对其抑郁行为产生改善作用。中药复方天丝饮、四逆散、培元解郁方中、高剂量均能提高大鼠对蔗糖的偏好，体现出较强抗抑郁样作用，且与氟西汀的效应相近。

TRYKYN代谢和应激引起的激素变化关系密切，糖皮质激素水平持续升高可以增加肝内主要限速酶TDO的表达和活性，从而改变TRYKYN代谢。促进TRYKYN代谢会耗竭TRY，导致5HT合成减少，皮质醇产生增加，大脑皮质兴奋，表现出情绪不稳、烦躁失眠等抑郁症状[7]。KYN可代谢产生QUIN和KA，与抑郁症的发生有直接关系[811]。其中，QUIN为NMDA受体的内源性激动剂，QUIN生成增加，可能产生兴奋性神经毒性作用，使神经元轴突损伤。KA则是NMDA受体的内源性拮抗剂，能对抗QUIN产生的神经毒性作用，可以保护神经。相关研究显示，选择性NMDA受体拮抗剂，如CGP37849、MK801、GMP等，能使小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间明显缩短，发挥抗抑郁作用。而激活NMDA受体可产兴奋性毒性作用，使海马神经元受到损害，并使氧化应激反应加重，最终导致抑郁症[1215]。

此外，过多的KA又能够增强肝外组织IDO的活性[16]，导致TRY进一步减少，5HT含量降低，后者是抑郁症形成的主要原因，并与其受体5HT1A减少密切相关[1718]。

IDO活性可通过产物KYN/TRY的比值判断，比值越大，则酶的活性越大[19]。本实验中，各给药组对KYN/TRY比值有明显降低作用，显示出抑制IDO活性的作用。其中，天丝饮可降低TDO和IDO mRNA的表达水平，因此，降低糖皮质激素引起的TDO、IDO表达增加，可能是天丝饮产生抗急性应激抑郁的机制。另外，天丝饮和培元解郁方中剂量能够降低QUIN的含量，提高KA的含量，表现出抑制喹啉酸兴奋性毒性，提高KA神经保护作用的调节机制。四逆散和培元解郁方中、高剂量则表现出增加海马5HT1A mRNA表达，提高5HT神经系统功能的作用。

总之，天丝饮、四逆散和培元解郁方均有改善氢化可的松引起的大鼠抑郁行为作用，其机制与抑制IDO引起的TRY代谢异常有关。其中，天丝饮对TDO、IDO表达有较明显的抑制作用，并能通过调节QUIN和KA的产生发挥神经保护作用。四逆散能明显促进5HT系统神经元功能。合方培元解郁方能通过上述综合机制发挥抗抑郁作用，但对TDO、IDO表达作用不及天丝饮。结合本课题前期研究成果[4，20]，我们认为，抑制IDO，有效地降低TRY代谢异常造成神经损伤，并通过5HT5HT1A调节神经元功能，可能是培元解郁方抗抑郁的机制。

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