芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效研究

吴泊 邵幼姿 薛莉丽 潘雯斓

摘要目的：探讨芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效。方法：采用系统数值化和数值系统调控技术对发酵炮制条件进行合理适量优化，用角叉菜胶法对小鼠尾部进行了血栓实验，检测了大鼠纤溶和凝血指标。结果：在相同剂量下（1 000 U/mL）A红发组（红花与C213共发酵组）比其余各组有明显缩短血栓长度（P<005），凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）以及活化的部分凝血活酶时间（APTT）被延长，明显缩短优球蛋白溶解时间（ELT）的作用（P<005）。结论：红花通过C213菌种发酵炮制后可有效提升纤溶活性、抗凝作用，增大溶血栓的药效。

关键词芽孢杆菌；发酵炮制；中药红花；增强；溶血栓；抗凝；纤溶活性；药效

Study on the Efficacy of Bacillus Fermented Chinese Medicine Flos Carthami in Enhancing Thrombolytic Effect

Wu Bo， Shao Youzi， Xue Lili， Pan Wenlan

（Department of Pharmacy， Yixing People′s Hospital， Jiangsu University， Yixing 214200， China）

AbstractObjective：To explore the efficacy of bacillus fermentation processing Chinese medicine Flos Carthami in enhancing thrombolytic effect. Methods：Numerical system and system of numerical control technology were used for reasonable proper optimization of fermentation processing conditions. The carageen glue method was carried out on mice tail thrombosis experiment to test the fibrinolytic and blood coagulation index of rats. Results：Under the same dose （1 000 U/mL）， A red hair group （Flos Carthami and C213 fermentation group） significantly shorten thrombus length than the rest of the groups （P<005）. The effective extension of thrombin time （TT）， prothrombin time （PT） and activated clotting time （APTT） live enzymes were delayed， and significantly shorten euglobulin dissolution time （ELT） effect （P<005）. Conclusion：Flos Carthami by C213 strains fermentation processing after anticoagulant effect， can effectively improve fibrinolytic activity， and increase the efficacy of dissolving thrombus.

Key WordsBacillus； Fermentation processing； Chinese medicine Flos Carthami； Enhanced； Dissolve thrombus； Efficacy

中圖分类号：R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.049

微生物所自有的酶系会影响物质转化，但必须是在条件温和的情况下，生成全新的物质。中药炮制时需在中药中使用微生物发酵，有利于药物药效的发挥；利用微生物发酵可将药物进行转变，成为更容易被人体吸收的小分子；中药的有效成分可借助微生物代谢生成全新的药物，其药效发挥更佳。微生物发酵的次生代谢产物和药物成分可以发生协同作用，这样可以增强药效。红花Carthamus tinctorius L属于菊科植物红花中的干燥花，其功效主要是祛瘀止痛、活血通络。红花是一种活血通络、去瘀止痛的良药，属于菊科植物红花的干燥花[2]。最近几年被广泛用于血行不同，淤血阻滞，另外，红花对降血脂、抗血栓也十分有疗效。本文炮制中药红花采用的微生物是一株高纤溶酶活性的地衣芽抱杆菌，对共发酵条件进行研究，同时进行发酵产物药效实验，明确其的药效作用。

1材料与方法

11材料

111药物红花，产地四川简阳，经过鉴定被归为菊科植物红花Carthamus Tinctorius的干燥花。

112动物实验所需60只SD大鼠均由相关中药研究所实验动物中心提供，体重为240 g左右，差值在20 g以内，雌雄各30只。动物饲养条件：饲养环境温度为18～29 ℃，日温差≤3 ℃，相对湿度达40%～70%，新鲜空气换气次数10次/h，气流速度≤018 m/s，压差25 Pa，洁净度1万级，氨浓度15 mg/m3，噪声≤60 dB，照度150～300 Lux。饲料应无菌、高营养，每次投放3～4 d的饲料，添加熟鸡蛋和灭菌葵花籽。）

113菌种本实验室将地衣芽抱杆菌C213分离后，由中国科学院某生物研究所环境研究实验室鉴定、传代保存。

114试剂凝血酶（中国药品生物制品鉴定所，批号：31022822）；冻干人纤维蛋白原（中国药品生物制品鉴定所，批号：210950031）；角叉菜胶（sigma公司，批号：8001794）；蚓激酶肠溶胶囊（北京百奥药业有限公司，批号：20320902）；凝血酶时间，凝血活酶时间，凝血酶原时间，纤维蛋白原试剂盒（太阳诊断系列产品）；其他试剂均为分析纯。

12方法

121发酵操作流程红花发酵采用的是生长曲线法，将红花全花置于40 ℃高温干燥后粉碎，然后采用200目筛进行过滤，以进一步研究在C213在生长过程中受到红花的影响程度，对各个培养时间段OD值通过30 nm测量，以此OD值来绘制其生长曲线。C213菌株数值系统调控技术、发酵培养基发酵条件调控、优化采用系统数值。

122纤溶酶活检测纤溶酶活的检测主要是采用Mullertze和Astrop的方法制定标准化的纤维蛋白平板，并将样品用微量注射器注射于平板上，恒温保持37 ℃，持续9 h，之后采用游标卡尺对溶斑的垂直直径进行测量，将溶斑垂直直径与尿激酶标准曲线做比较，得出酶活单位。

123药效实验

1231正常大鼠凝血及纤溶指标的影响动物分组给药：每组10只大鼠，5只雌鼠，5只雄鼠，每天按量给每组用药，每天为大鼠灌胃001 mL/g，并持续10 d。指标观察以及检测方法：凝血酶时间（TT）、血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）的测定用ACL200全自动血凝仪及其配套产品（美国Coulter公司，型号：ACL200）；优球蛋白溶解时间（ELT）测定按药理实验方法学；纤维蛋白原（FIG）的测定用采用Clauss凝固法。

1232小鼠尾部血栓检测将所有小鼠随机分配，分为6组，雌鼠、雄鼠各5只，每组公10只小鼠，分别为A对照（磷酸缓冲液002 mol/L），B红混（将白发浓缩2倍与25 g/L红浸等体积混合），C红发（C213与红花一起发酵加清液1 000 U/mL），D红浸（红花水提液25 g/L），E蚓激酶（配置成1 000 U/mL），F白发（C213发酵加清液1 000 U/mL），每天为小鼠分别灌胃001 mL/g。持续3 d后，为小鼠做尾部血栓造型，采用的方法为角叉菜胶法。用药2 d，之后对血栓出现情况进行观察，并测量长度。

13统计学方法采用SPSS 220统计软件，计数资料用百分数（%）表示，采用χ2检验；计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验。以P<005为差异有统计学意义。

2结果与分析

21发酵炮制的优化将培育基采用数值系统调控技术和系统数值化进行优化和调控。使用系统数值化和数值系统调控技术调控、优化了培养基。X1X8为碳源含量（%），X9X22为氮源含量（%），分别是糖蜜、葡萄糖、大豆蛋白陈、玉米蛋白粉等；X23X29为无机盐含量（%），分别是MgCl2、ZnSO4等，X30X34为发酵条件，X30表示pH，X31表示装量（%），X32表示温度（℃），X33表示接种量（%），X34表示发酵时间（ h），Y表示发酵液的酶活（U/mL）。有5项试验是采用系统因素量的优化配置进行的，原系统因素由原来的34个缩减了21个剩13个，试验结果见表1共发酵前。红花含量0～30（g/L）成为其中的一个因素，也就是说将优化后的地衣芽抱杆菌C213和培养基中加入到X35中一起发酵，以此达到最大优化程度提高发酵条件，结果见表1共发酵后。

22红花剂量对C213生长的影响结果在0%～5%的不同含量条件下，红花对C213的生长也会产生不同的影响，或促进或抑制，当培养基中的红花含量为0～30 g/L，可促进地衣芽抱杆菌的生长，当红花含量超出30 g/L，则会抑制其生长，所以在研究过程中对红花的使用比例要合理。值得关注的是当红花含量在20～30 g/L，在促进C213生长的同时还延长了其生长期，对微生物作用于红花有效成分纤维酶的产生和发酵炮制提供有利条件。

C213菌株发酵液的酶活性在未添加红花的情况下仅为665 U/mL，而红花与C213菌株混合发酵之后提高了藥效的活性，如表2。这个结果提示C213菌株的次代谢产物和红花中的有效成分可相互作用，提高纤维蛋白的溶解效果。

23小鼠尾部血栓抑制为小鼠经下皮注射后，小鼠尾部会出现暗红色血栓，而且暗红色血栓会逐渐扩大到一定范围，经过一定时间之后，暗红色转变为紫色，紫色变为黑色，和正常尾分界非常明显，结果见表2。在一样的水平下，F组明显可以抑制小鼠尾部血栓的发生率，而且效果也很好。

24大鼠凝血及纤溶指标结果

241凝血效果比对对凝血酶时间、凝血活酶时间、凝血酶原时间进行测定，反映机体内外源性凝血的途径。如下表中，B，C，D，E，F组和A组作比较，发现在同等药剂量下，F组凝血酶时间、凝血活酶时间、凝血酶原时间有效延长，且差异明显，说明A红花组对内外源性凝血系统有抑制作用，且效果超出其他组。

242纤溶系统影响比较溶栓药物评定中对药物溶栓效果通过优球蛋白溶解时间、纤维蛋白原反应，如表2，A组与其他组进行比较发现，在同样药剂量情况下，F组可有效缩短小鼠血液中优球蛋白溶解时间，与其他组差异有统计学意义。血浆纤维蛋白原的含量虽然比以前低，但是变化并不明显，这就表明药剂量并不影响机体的凝血机制，而且其不良反应也小。

3讨论

使用微生物技术发酵炮制中药就是将生物进行转化。将微生物生长分泌的胞外酶混入培养基中，作用于培养基中的微生物与中药发生化学反应，也就是说微生物对中药的发酵炮制有很好的效果。微生物发酵炮制中药的机理就是利用微生物的转化能力。现代发酵工程证明，微生物具有很多能力，例如氧化、酯化、还原化[5]。所以说，利用微生物发酵炮制中药其实就是利用酶催化中药中的有效成分，并将有效成分改性的生物转化过程。红花能抗凝血、降血栓的有效成分是其中的红花醌苷和红花黄色素，它的作用机理是将其溶解，将人体内纤溶酶原激活剂激活，将其激活为纤溶酶，从而起到溶解血栓的作用[6]。红包中有很多糖苷类化合物，而糖苷类化合物主要是由葡萄糖和酚羟基缩合形成的。当糖苷水解酶时就会将这些葡萄糖水解掉，葡萄糖水解掉之后，酚羟基的数目就会增大，从而提高红花的抗氧化活性[7]。另外，糖苷化合物水解之后产生的苷元比较容易吸收，生化转化率高，更能发挥出其的药理作用。发酵一方面能够促使微生物形成各种各样的此生代谢产物，这些代谢产物本身就是功效较好的药物[8]；另外一方面可以根据微生物中含有的酶定向地转化成为某种药物，使其的功效朝着预先的方向发展，例如已知某种生物中含有某种酶，而含有的这种酶可以将某种化合物结构改变，从而产生新的化合物[9]。或者是把中药中的有效成分作为基础，经过微生物代谢产生新的化合物，微生物代谢产生新的化合物和中药中的成分可以形成新的化合物。微生物在中药环境中能够发生新的代谢反应，这是由于中药中的某些成分对微生物的代谢和生长有抑制或者是促进作用，以此来改变微生物的代谢途径，改变代谢途径后形成新的成分[10]。微生物分解是将中药中的有毒物质分解掉，分解掉之后降低中药的不良反应，另外，微生物的分解作用也可以使中药中不容易消化吸收的大分子物质直接转化为小分子物质，转化成的小分子物质非常容易被肠道吸收掉[11]。

利用小鼠尾部血栓实验对C213红花发酵液所含的药效成分进行测定；用纤维蛋白原和优球蛋白溶解时间作为纤溶作用的测定指标；测定凝血活酶时间和凝血酶时间等反映机体内凝血途径的情况[12]。红花组的小鼠尾部血栓长度明显比其他组的小鼠尾部血栓长度短，降低了FIG的含量，缩短了ELT的时间，延长了PT、TT的数值，这就说明红花与C213共发酵炮制后对机体内的内外源性凝血体系有很好的抑制作用，纤溶酶得到提高，有效发挥红花酵液的溶栓、抗栓作用[13]。

通过分析红花中的有效成分可得，发酵炮制后溶栓作用和C213产生的糖普水解酶有关系。红花中很多糖普类化合物都是由酚羟基和葡萄糖缩合而成。例如6羟基山萘酚30葡萄糖苷，6羟基山萘酚7O葡萄糖苷，新红花苷，槲皮苷等[14]。糖苷键上的葡萄糖被糖苷水解酶水解之后生成的苷元相比未水解的苷元吸收效果更好，同时提高了生物利用率，红花中的有效成分可更好地发挥药理作用。

前期准备工作将C213和红花共发酵物质的成分采用HPLC做了测定，结果发现红花中消失了一个保留时间为7624分的吸收峰，新出现了2个保留时间1245分的吸收峰。发酵后血栓能力的提高可能对其造成了影响，最根本的是与C213的发酵炮制有关系[15]。深入研究需采用磁共振成像等先进设备。

微生物的分解转化能力极强，能够产生次生代谢产物，利用微生物发酵技术来炮制中药，微生物技术改变药物理性比物理化学炮制手段提高药性更强，而且还可以降低药物的不良反应，扩大了适应证[16]。但微生物技术在药物炮制中的潜能并没有彻底发挥出来，所以说深入研究微生物在中药炮制中的物质基础对中药现代化和新的活性产物有着非常重要的意义。

微生物发酵就是利用微生物代谢过程来产生酶，产生的酶能够催化底物，目前的微生物整体细胞能够为反应催化剂的生物催化技术和生物转化提供较好的基础，其专一性强，条件简单，是生物转化技术中发展最为迅猛的分支之一，尤其是提取分离技术的改进，分离技术的改进使微生物发酵技术的应用不在局限于小分子的转化和药物酿造，而是广泛用于天然化合物的生物合成、生物催化物的合成、光学活性化合物的拆分、新药物的开发、药物前体化合物的转化等各种领域[17]。到目前为止，微生物技术已经应用于50多种反应，其中有水解、酯化、水合、酰化、脱水、氨化、芳构化、异构化等有机化学反应，还有羟基化、脱氢、氢化、环氧化等各类氧化还原反应以及各类重要药物的合成转化领域[18]。

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（2017-08-09收稿责任编辑：王明）