非小细胞肺癌患者胸腔积液与外周血ctDNA中EGFR基因突变检测的对比研究

徐敏 何婉 李岚 朱美琴 陈亦欣 许瑞莲

【摘要】目的比较晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者胸腔积液与外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）中EGFR基因突变间的差异。方法用高通量测序技术同时检测22例晚期NSCLC患者的胸腔积液ctDNA与外周血ctDNA的EGFR基因突变情况，以外周血ctDNA为金标准，分析胸腔积液ctDNA对EGFR基因突变的檢测效果。结果以外周血ctDNA检出的EGFR基因突变结果为金标准，胸腔积液ctDNA中检出NSCLC基因突变的灵敏度为86%～100%，特异度达94%～100%，与外周血ctDNA结果的总体符合率为95%～100%，且胸腔积液ctDNA检测出的突变丰度高于外周血ctDNA（P=0002）。结论晚期NSCLC患者胸腔积液和外周血ctDNA中EGFR基因突变检测结果一致，胸腔积液检测丰度较高，具有良好的临床应用价值。

【关键词】非小细胞肺癌；高通量基因测序；循环肿瘤脱氧核糖核酸

Comparison of EGFR gene mutation detection between pleural effusion and peripheral blood ctDNA in patients with nonsmall cell lung cancerXu Min， He Wan， Li Lan， Zhu Meiqin， Chen Yixin， Xu Ruilian Department of Medical Oncology， Shenzhen Peoples Hospital， the Second Clinical Medical College of Jinan University， Shenzhen Cancer Institute， Shenzhen 518020， China

Corresponding author， Xu Ruilian， Email： xuruilian@126com

【Abstract】ObjectiveTo compare the differences in the EGFR gene mutation detection between the pleural effusion and peripheral blood circulating tumor DNA （ctDNA） in patients with advancedstage nonsmall cell lung cancer （NSCLC） MethodsThe EGFR gene mutation in the pleural effusion and peripheral blood ctDNA of 22 patients with advancedstage NSCLC were detected by nextgeneration sequencing （NGS） The ctDNA gene detection in the peripheral blood was considered as the golden standard The detection effect of EGFR gene mutation upon the pleural effusion ctDNA was evaluated ResultsThe EGFR gene mutation in the peripheral blood ctDNA was considered as the golden standard The sensitivity of detection of NSCLC gene mutation in pleural effusion ctDNA was 86%100% and the specificity was 94%100% The overall consistent rate with the results of peripheral blood ctDNA was ranged from 95% to 100% The mutation abundance detected in the pleural effusion ctDNA was significantly higher than that in the peripheral blood ctDNA（P=0002） ConclusionsThe outcomes of EGFR gene mutation are consistent between the pleural effusion and peripheral blood of patients with advanced NSCLC The mutation abundance of the pleural effusion is higher compared with that of the peripheral blood， which is worthy of clinical significance

【Key words】Nonsmall cell lung cancer； Nextgeneration sequencing； Circulating tumor DNA

非小细胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌患者发病率的80%～85%，其中约50%的患者确诊时已为晚期，5年生存率低于5%。随着分子病理学的发展，越来越多肺癌驱动基因被发现，给患者带来了全新的治疗策略。表皮生长因子受体基因（EGFR）作为最受关注的肺癌靶标基因，其突变状态是决定EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFRTKI）疗效的关键。然而目前临床上大部分NSCLC患者在确诊时已为ⅢB～Ⅳ期，无法手术，无法获取肿瘤组织或组织不足造成难以进行分子检测。近年有研究表明，外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）所检测的EGFR突变与组织DNA检测的特异度相似，灵敏度尚待提高[13]。而ctDNA中检出EGFR突变阳性者接受EGFRTKI治疗生存期获得延长[12]。基于此，通过外周血ctDNA检测EGFR基因突变已获得专家认可，达成共识[4]。晚期NSCLC患者常伴有恶性胸腔积液（MRE），胸腔积液的采集较为简便、易行，对于无法获取肿瘤组织的患者而言也是一个良好的基因检测替代标本。然而，胸腔积液ctDNA与外周血ctDNA用于EGFR基因检测时何种更精确尚未知。为此，近期笔者通过高通量基因测序亦称下一代测序（NGS）技术检测22例晚期NSCLC患者胸腔积液ctDNA中的EGFR基因突变情况，并以外周血ctDNA作对照，现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

选取2014年11月至2015年12月我院收治的ⅢB～Ⅳ期NSCLC合并MRE（经细胞病理学证实）患者22例，所有患者均抽取外周血及胸腔积液标本。其中男13例、女9例，年龄35～70岁、中位年龄50岁，腺癌20例、鳞癌2例。本研究經医院医学伦理委员会批准，所有患者均已经签署知情同意书。

二、方法

1采集血样及抽取胸腔积液

清晨在患者空腹状态下抽取肘静脉血5 ml，立即在室温下以2 000转/分离心10 min，分离血浆和血细胞，小心采集上层血浆，注意避免触及血细胞。临床抽取新鲜胸腔积液样本约15 ml，同样以2 000转/分离心10 min，弃上清。如细胞量过少，可重复加入胸腔积液后再离心。

2血浆和胸腔积液样本DNA提取

用Qiagen DNA提取试剂盒提取血浆和胸腔积液样本中的DNA，具体操作参照试剂盒说明书进行。

3ctDNA分离

应用薄膜柱吸附试剂盒分别从血浆和胸腔积液中分离ctDNA：将DNA定量后按试剂盒说明书取20 ng以上进行DNA文库构建，步骤包括：ctDNA大片段分离、小片段回收、DNA末端修复和A接头连接、在DNA的两端加上Illumina测序试剂盒的专用接头、依据所需DNA片段大小进行磁珠筛选、应用PCR法扩增文库用于探针杂交捕获及测序实验。

4生物素标记探针捕获基因

应用杂交富集探针（Geneseeq）对已建好的DNA文库进行目标基因靶标富集及扩增，包括：DNA捕获探针与文库杂交；清洗和回收捕获的文库产物；捕获文库与链霉亲和素磁珠结合；磁珠捕获文库清洗，去除非特异性结合的文库。

5高通量基因测序

血浆样本和胸腔积液提取ctDNA后送南京世和基因生物技术有限公司进行全基因检测。将捕获后的文库在Illumina HiSeq 4000高通量测序平台上样，DNA在Illumina试剂盒Flew cell上形成DNA簇，测序平台相继通过单碱基合成后暂停、荧光检测、合成恢复的循环完成DNA高通量测序。

6数据分析

将高通量基因测序结果与中国人种hg19基因组数据对比，完成基因Mapping工作。同步分析各种基因突变类型，分析生成肿瘤特有突变和种系突变。

三、统计学处理

应用SPSS 200分析数据。以外周血ctDNA结果为对照，分析各病例胸腔积液ctDNA对NSCLC基因突变的诊断效能，计算胸腔积液ctDNA诊断NSCLC基因突变的灵敏度、特异度及总体符合率。用符号秩和检验对比胸腔积液和血浆EGFR基因突变检测丰度。P<005为差异有统计学意义。

结果

一、胸腔积液的EGFR基因突变情况分析

22例合并MRE的NSCLC患者的胸腔积液标本中，12例检测到EGFR基因突变，突变率为55%（12/22）。12例EGFR基因突变标本包括：5例（42%）19号外显子缺失突变，该5例中有1例同时合并20号外显子T790M原发耐药突变；6例（50%）21号外显子L858R点突变；1例不常见的A289F突变。19外显子缺失突变和21外显子L858R点突变共占总体突变类型的92%（11/12）。

二、外周血的EGFR基因突变情况分析

22例合并MRE的NSCLC患者的外周血标本中，11例检测到EGFR基因突变，突变率为50%（11/22）。11例EGFR基因突变的标本包括：5例（42%）19号外显子缺失突变，该5例中有1例同时合并20号外显子T790M原发耐药突变；5例（42%）21号外显子L858R点突变；1例不常见的A289F突变。19外显子缺失突变和21外显子L858R点突变共占总体突变类型的91%（10/11）。

三、配对样本中胸腔积液和外周血EGFR基因突变的一致性及检测丰度的比较

以外周血ctDNA检出的基因突变结果为金标准，胸腔积液ctDNA对NSCLC基因突变的灵敏度为86%～100%，特异度达94%～100%，与外周血ctDNA结果的总体符合率为95%～100%，见表1。其中，有1例患者外周血ctDNA中未检出突变，但相应胸腔积液ctDNA中则检测出EGFR 21号外显子L858R点突变。而在检测丰度方面，胸腔积液ctDNA检测出的突变丰度高于外周血ctDNA（Z=-3509，P=0002）。

讨论

在目前NSCLC的诊治中，基因分型指导下的个体化治疗对于指导用药至关重要。其中，针对EGFR基因突变的EGFRTKI的应用给NSCLC患者带来了巨大的生存获益。但是，大部分NSCLC患者在诊断时均为晚期，难以获取肿瘤组织。而且，由于肿瘤的异质性，根据初诊时的组织标本指导后续的治疗可能存在偏倚。鉴于此，液体活组织检查（活检）技术在肿瘤分子检测中崭露头角，体液（主要为外周血，还有胸腹腔积液、尿液、唾液）中的循环肿瘤细胞（CTC）、ctDNA、外泌体等肿瘤来源的生物标志物，为肺癌的精准诊断和个体化治疗提供了很大的助力[5]。

ctDNA指恶性肿瘤体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统的小片段DNA，可以出现与原发肿瘤DNA相同特征或基因改变：如点突变、超甲基化、微卫星不稳定性（MI）、杂合性缺失（LOH）等多种类型的基因修饰变异[6]。前瞻性研究表明，外周血ctDNA与肿瘤组织相比，其EGFR基因突变的检测同样具有较高特异度，灵敏度有待提高。外周血ctDNA检测出EGFR突变阳性的患者接受吉非替尼治疗后，较标准化学治疗的患者客观缓解率明显提高，无进展生存期明显延长[12]。因此，中国NSCLC患者EGFR基因突变检测专家组认为，当肿瘤组织难以获取时，外周血ctDNA可作为EGFR基因突变检测的合理替代选择，并写入了2016年专家共识[4]。

MRE是晚期NSCLC患者常见合并症之一。在肿瘤组织难以获取时，胸腔积液可以作为细胞学检测的替代。但由于胸腔积液标本易受采集分离等种种因素干扰，其在EGFR基因突变检测效能报道不一。国内禹乐等[7]应用实时荧光定量PCR的方法检测发现，同一患者的胸腔积液细胞中提取的DNA质量与组织标本相近，浓度却普遍略低，但检测的总体EGFR突变率相近。赵士伟等[8]用ADxARMS方法检测了胸腔积液和肺癌组织标本的EGFR基因突变率，也发现两者比较差异无统计学意义。

胸腔积液与外周血ctDNA在NSCLC患者EGFR基因突变检测方面孰优孰劣还没有定论。由于循环中存在的ctDNA极其微量，对检测技术提出了很高的要求。NGS一次可以针对几十万至几百万条DNA分子进行序列测定，所需的DNA样本量极少，适用于ctDNA这种微量DNA的检测，在肿瘤诊断方面表现出较高的灵敏度和特异度。Couraud等[9]用NGS技术检测了68例晚期NSCLC患者配对肿瘤组织的外周血ctDNA，结果显示外周血ctDNA含量与分期和转移灶数目相关，其相比组织检测的灵敏度为58%，特异度为87%。Newman等[10]应用NGS技术检测NSCLC患者血浆ctDNA，发现在Ⅱ～Ⅳ期的患者中，检测灵敏度达100%，Ⅰ期患者的灵敏度为50%，而各期肺癌患者的特异度均为96%。NGS技术从而也被公认为是检测ctDNA的“金标准”[11]。

本研究通过NGS技术检测晚期NSCLC患者胸腔积液及配对外周血中的ctDNA，并进行多基因联合检测以及对比分析，比较两者间的差异。结果发现，以外周血ctDNA检出的基因突变结果为金标准，胸腔积液ctDNA对NSCLC基因突变的灵敏度为86%～100%，特异度达94%～100%，与外周血ctDNA结果的总体符合率为95%～100%。其中，有1例患者外周血ctDNA中未检出突变，但相应胸腔积液ctDNA中则检测出EGFR exon 21号外显子L858R点突变，为应用EGFRTKI提供了良好的依据。在检测耐药突变基因T790M方面，两者也达到了一致。而在检测丰度方面，胸腔积液ctDNA检测出的突变丰度高于其对应的外周血ctDNA。究其原因，可能系胸腔积液中脱落出的肿瘤细胞片段DNA较释放入血的更多，更易被检测到。

外周血ctDNA作为液体活检的重要组成，可以说是一种新型的肿瘤标记物，可实时反映出恶性肿瘤发生、发展过程中基因异常的动态变化，且与组织活检标本相比，具有操作简便、损伤小、患者易接受、可反复取材等优势。本研究显示，用NGS技术亦能检测出微量的胸腔积液ctDNA，与外周血相比，具有相同的检测效能，甚至检测丰度更高，从而为NSCLC患者的EGFR基因突变检测开辟了新途径。胸腔积液和外周血ctDNA的检测及其生物学指标的研究，将有可能为晚期NSCLC患者的诊断、预后判定及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创的分子生物学检测手段。

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（收稿日期：20170801）

（本文编辑：林燕薇）