猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体检测与分析

邵胜勇

摘要：口蹄疫是世界动物卫生组织（OIE）规定的A类烈性动物传染病，我国列为一类动物传染病。口蹄疫共有7种血清型，亚洲I型是其中一种。目前，国内还没有对猪亚洲I型口蹄疫进行强制免疫，我们通过2015-2017年对13958头猪进行亚洲I型口蹄疫免疫抗体的检测，旨在对本地区猪群通过免疫口蹄疫O型-亚I型疫苗产生的抗体进行监测，掌握群体免疫抗体水平，评价免疫疫苗的有效性，并对免疫效果进行总结，对生产中发现的问题进行分析，提出解决的对策。方法为：猪群在免疫口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗28 d至4个月之间，免疫次数从一免至五免，采集猪血清，以亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，定量检测样品抗体水品。通过分析检测数据，得出如下结论：猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体阳性率和抗体水平总体不高，但具备较好的保护力；商品猪免疫抗体阳性率和抗体水平均高于种猪；免疫抗体阳性率随免疫次数增加呈逐渐上升趋势，但四免后阳性率下降，到五免时则再次上升。通过检测免疫抗体，分析其变化特征及规律，为猪亚洲I型口蹄疫的防控、研究及免疫提供依据。

关键词：口蹄疫；亚洲I型；免疫抗体；检测

中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.002

1 方法

1.1 疫苗

疫苗均为口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗，中牧实业股份有限公司兰州生药厂生产。

1.2 疫苗免疫及样品采集

由于实际生产中不对猪进行亚洲I型口蹄疫单独免疫，因此免疫程序均按照口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗的免疫程序进行免疫，即仔猪30日龄时首免，1个月后二免，之后每4个月免疫1次。 所检测血清样品均为免疫后28天至4个月以内的样品，免疫次数从一免至五免。无菌采集血液，经离心，分离出血清进行检测。2015-2017年检测样品数分别为4689份、3314份、5955份，其中一免至五免样品数分别为3455份、4905份、2234份、1784份、1580份，种猪检测数6799份、商品猪检测数7159份。

1.3 抗体检测试剂盒

亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，购自中国农科院兰州兽医研究所。

1.4 抗体检测方法

亚洲I型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA方法，操作步骤如下：

1.4.1 稀释血清

在U型反应板上，以50μL/孔的量用1×PBST将待检血清从1：4开始做2 倍连续稀释至1：512（即每列第一孔加入75μL1×PBST，再加入25μL被检血清，其余7孔各加入50μL1×PBST），阳性对照血清从1：2稀释至1：256，阴性对照血清从1：2稀释至1：4。设病毒抗原对照孔4孔。

1.4.2 加病毒抗原

将病毒抗原用1×PBST稀释至工作浓度，向被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，各加入50μl，4孔病毒抗原对照孔各加入100μl。封板，振荡，4℃静置过夜或者37℃温育90 min。

1.4.3 将U型反应板上的抗原抗体混合液按次序转移到已包被口蹄疫亚洲I型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，37℃温育60 min。

1.4.4 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入口蹄疫亚洲I型豚鼠抗体工作液，封板，37℃温育30 min。

1.4.5 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封板，37℃温育30 min。

1.4.6 洗板3～5次，甩干，按50μL/孔加入底物溶液（务必加双氧水，每1 ml底物溶液加入10μL3%双氧水），封板，37℃温育15 min，每孔再加50μL终止液终止反应，立即在492 nm波长下读取光吸收值（D492 nm值）。

1.5 结果判定

1.5.1 试验认可标准

每块板设4孔抗原对照，病毒抗原对照D492 nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1：1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应<1：8。

1.5.2 血清抗体效价判定

抗原对照4孔，弃去最高和最低D492 nm值，计算其余2孔的平均D492 nm值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照D492 nm值。被检血清D492 nm值大于临界值的孔为陰性孔，小于等于临界值的D492 nm值孔为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的D492 nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔D492 nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。抗体效价计算对照表见试剂盒使用说明书。

1.5.3 结果判定

参考该试剂盒规定的牛羊亚洲I型口蹄疫抗体效价同保护力的关系，即“抗体效价≥1：128，保护率99%”的标准，作为猪的免疫保护临界线，即：抗体效价≥1：128判定为亚洲I型口蹄疫抗体阳性，抗体效价<1：64，判定为阴性，介于1：64～1：128时，判定为可疑。群体免疫抗体阳性率≥70%即表明该群体对亚洲I型口蹄疫具备免疫保护力。

2 结果

通过2015-2017年连续3年中检测到的猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体，3年检测样品13958份，整体平均免疫抗体阳性率为37.84%。按照年度逐月对检测结果进行统计，免疫抗体阳性率如表1所示；2015-2017年平均抗体效价如表2所示。

按照养殖类型的不同，将检测样品按照种猪、商品猪进行分类统计，按年度计算免疫抗体阳性率及抗体效价，结果如下表3。

检测样品从免疫1次至免疫5次，统计各年份中所检测样品不同免疫次数下免疫抗体阳性率及抗体效价，得到表4所示结果。

3 分析与结论

统计3年的免疫抗体检测结果（见表4），猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体阳性率较低，整体平均为37.84%，平均抗体效价也较低，主要原因为，用于免疫的口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗为牛源疫苗，用于猪的免疫，其免疫原性较低，不能产生很好的免疫应答。从实际生产情况看，猪患亚洲I型口蹄疫的症状及程度并不严重[1]。通过大量的检测数据，虽然总体免疫抗体阳性率与免疫抗体效价均较低，但被检测到的个体及其所在的群体并未发生亚洲I型口蹄疫，因此可以认为，在坚持对猪群实施免疫的情况下，猪只对亚洲I型口蹄疫是具备抵抗力的。按照种猪（后备种猪）、商品猪分析免疫效果，商品猪不论从免疫抗体阳性率还是抗体效价来看，都要高于种猪。后备种猪一般在8月龄进行首次配种，配种前1个月免疫1次（即三免），配种后则按照4个月免疫一次的程序进行免疫管理。而商品猪生长周期较短，一般在5个月左右，其免疫程序基本是按照30日龄、65日龄、95日龄、125日龄进行免疫，免疫间隔较短，免疫抗体保持在较高水平。种猪（后备种猪）、商品猪之间免疫程序的差异导致了两者间免疫抗体的差异。

韦显凯[2]等通过对猪口蹄疫免疫抗体的研究，得到结果是抗体阳性率一免、二免、三免依次升高，但没有对四免及以后免疫情况进行研究，本文则将检测的对象扩大到五免以后。从免疫次数看，一免至三免，免疫抗体阳性率均呈逐渐上升的趋势，但四免后免疫抗体阳性率却均呈下降走势，到五免时则再次上升。这个现象目前尚无同样报道或研究。通过对相关猪场进行调查，分析造成此现象的原因主要是：后备母猪首次配种时间一般在220～260日龄，而按照疫苗免疫程序，三免的时间在7～8月龄，配种时间恰好与三免时间重合，而猪场为了疫病防控的需要，会在配种前1个月对后备母猪实施免疫，免疫后再行配种。而四免时间在11～12月龄之间，此时的母猪妊娠期已达3～4个月，按照免疫程序应该实施免疫，但母猪即将临产，为减少对母猪及胎儿的影响，免疫时间会被推后至分免疫后進行，这对免疫抗体的产生有一定影响。另一方面，生产后的母猪体内激素水平的变化也可能对免疫抗体的产生具有一定影响。 本项检测中所采样品为口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗免疫程序免疫所得样品，各场在实际生产中，免疫程序往往与疫苗推荐程序有差异，后备母猪基本能按照4个月免疫1次的推荐程序进行免疫，但商品猪则频繁免疫，基本是按照1月1次开展免疫，整个生长周期中免疫4次。本项检测中数据也表明，商品猪频繁免疫，其免疫抗体水平虽比后备母猪略高，但差异并不显著，因此其免疫程序并不合理。靳兴军等[3]曾对猪的口蹄疫亚洲I型疫苗探索免疫程序，研究确定了猪亚洲I型口蹄疫免疫程序：45日龄首免，间隔1.5～2个月二免，再间隔4～4.5个月三免， 以后每4～5个月免疫1次，以该程序进行免疫，免疫效果确实，该程序可以推荐作为商品猪免疫程序。

参考文献

[1] 黄武光.猪的亚洲Ⅰ型口蹄疫的发病特点及控制措施研究[J].中国动物保健，2008（12）：92-94.

[2] 韦显凯.规模猪场不同免疫次数对口蹄疫抗体产生效果的影响[J].南方农业学报，2014，45（3）：494-497.

[3] 靳兴军.猪亚洲I型口蹄疫免疫程序试验[J].中国兽医杂志，2006（9）：15-16.