美洲鲥形态特征及其两种同工酶的组织特异性分析

张涛 周剑光 陈建武 何力

摘要：【目的】從形态特征和生化遗传层面丰富美洲鲥种质资源研究内容，同时为筛选出鉴定美洲鲥种质的生化遗传标记打下基础。【方法】通过形态测量获取美洲鲥的可数性状和可量性状，并采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对美洲鲥6种组织（心脏、眼睛、肌肉、肝脏、肾脏和鳃）的乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）进行检测分析。【结果】美洲鲥体侧扁，呈纺锤形，背、腹缘呈浅弧形，背部灰黑色，略带蓝绿色金属光泽，体侧和腹部均为银白色；其鳍式为背鳍D.iii-13～15，胸鳍P.i-14～17，腹鳍V.i-7～9，臀鳍A.i～ii-16～20，尾鳍C.21～25。美洲鲥鳃耙近7字形，左侧第一鳃弓外侧鳃耙数24～37+47～64。LDH和MDH在美洲鲥心脏、眼睛晶状体、肌肉、肝脏、肾脏和鳃组织中的酶带数目及其活性各不相同，呈明显的组织特异性，且美洲鲥个体间也存在差异。【结论】美洲鲥同工酶表达的组织特异性受遗传基因调控，同时与各器官组织的生化代谢活动相关。实际生产中，建议选取鳃LDH作为鉴定美洲鲥种质的生化遗传标记。

关键词： 美洲鲥；形态特征；乳酸脱氢酶（LDH）；苹果酸脱氢酶（MDH）；组织特异性

中图分类号： S965.219 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0773-07

Morphological characteristics of Alosa sapidissima and tissue specificity of two kinds of isozymes in it

ZHANG Tao， ZHOU Jian-guang， CHEN Jian-wu， HE Li*

（Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products（Wuhan）， Ministry of Agriculture/Freshwater Fish Germplasm Quality Supervision and Testing Center， Ministry of Agriculture/Yangtze River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuhan 430223， China）

Abstract：【Objective】This paper was to enrich the studies about Alosa sapidissima gerplasm resources from the perspectives of morphological characteristics and biochemical genetics characteristics， and lay the foundation for screening the biochemical genetic markers that could identify A. sapidissima gerplasm resources. 【Method】Countable traits and measurable traits of A. sapidissima were determined by morphometry. By using vertical polyacrylamide gel electrophoresis， lactate dehydrogenase（LDH） and malate dehydrogenase（MDH） from six tissues（heart， eye， muscle， liver， kidney and gill） of A. sapidissima were detected and analyzed. 【Result】A. sapidissima had a flat fusiform body. Its back and abdomen were shallow arc. And the back were grey and dark， with slight blue-green metallic luster. Both sides of the body and the abdomen were silver white. The fin formulas of A. sapidissima included dorsal fin D.iii-13-15， pectoral fin P.i-14-17， anal fin A.i-ii-16-20， ventral fin V.i-7-9 and caudal fin C.21-25. The morphology of the gill racker was in 7-shape and the number of outer gill racker on the left first gill arch was 24-37+47-64. The isoenzyme band numbers and activity of LDH and MDH from heart， eye， muscle， liver， kidney and gill of A. sapidissima presented tissue specificity and individual variations. 【Conclusion】The tissue specificity of A. sapidissima isozymes is regulated and controlled by genetic genes， meanwhile it is related to the biochemical metabolism activities of the tissues. It is suggested to choose LDH from gill as biochemical genetic markers in A. sapidissima gerplasm identification.

Key words： Alosa sapidissima； morphological characteristics； lactate dehydrogenase（LDH）； malate dehydrogenase（MDH）； tissue specificity

0 引言

【研究意义】美洲鲥（Alosa sapidissima）隶属于鲱形总目（Clupeomorpha）鲱形目（Clupeifoemes）鲱科（Clupeidae）鲥亚科（Alosinae）西鲱属（Alosa），原分布于北美洲大西洋西岸水域，因其具有诸多的优良性状而被各国家和地区引种，现已呈全球性广泛分布（杜浩和危起伟，2004）。21世纪初我国开始引进美洲鲥受精卵进行孵化驯养，现已形成一定养殖规模，发展成为一个具有较高经济价值的优良养殖品种（张伟等，2017a）。中国鲥（Tenualosa reevesii）与美洲鲥同属于鲥亚科，二者外部形态非常接近，且均具有较高的营养价值和经济价值（郭永军等，2010），但中国鲥已濒临灭绝。因此，加强美洲鲥种质资源的开发研究，并作为中国鲥的替代品以满足市场需求，对缓解和保护中国鲥资源具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关美洲鲥的研究主要集中在渔业资源状况（杜浩和危起伟，2004；唐国盘等，2010；Latour et al.，2012）、养殖技术（潘庭双等，2006；张国喜等，2016）、生物学特征（刘金兰等，2008；洪孝友等，2011a）、生理学特性、营养成分（郭永军等，2010）、发育生物学（洪孝友等，2011b）及病原生物学（张伟，2017b）等方面，上述研究丰富了美洲鲥的形态学基础资料，同时有助于从形态上区分美洲鲥、中国鲥及孟加拉鲥（T. ilisha）等鲥亚科鱼类。此外，国内许多学者针对美洲鲥养殖过程中的生殖生理、光照需求及应激反应等开展了系列研究工作（徐钢春等，2012；高小强等，2015；洪孝友等，2016；张勇等，2016a，2016b；张伟等，2017b）。杜浩等（2007）研究發现，苯唑卡因更适合用于美洲鲥的运输麻醉；杨坤等（2008）、洪孝友等（2013）通过对比分析养殖美洲鲥的蛋白需求及肌肉营养成分，为美洲鲥饵料配方的优化提供科学依据；洪孝友等（2011b）、宓国强等（2014）通过观察分析美洲鲥早期胚胎及仔稚鱼的发育规律，认为严格控制水温和投喂适口饵料是保证其鱼苗存活率的关键；张伟等（2017a）研究表明，在长时间光照条件下，美洲鲥会产生强烈的应激反应，引起机体肾上腺素及血液中血糖和乳酸脱氢酶增加，进而导致耗氧率增大，因此实际生产中应尽量避免强光照或长时间光照，减少环境对美洲鲥造成的应激反应。【本研究切入点】不同鱼类具有不同的形态学特征，通过形态测量获取可数性状和可量性状数据，或构建判别方程，可直观便捷地鉴定不同种鱼类（丁严冬等，2015）；同工酶作为一种生化遗传标记，在鱼类的亲缘关系研究、物种分类鉴定及群体遗传结构分析等方面已得到广泛应用（Verspoor and Moyes，2005；Ardestani et al.，2014），但至今鲜见从形态特征和同工酶层面揭示美洲鲥生化遗传特性的研究报道。【拟解决的关键问题】通过形态测量获取美洲鲥的可数性状和可量性状，并结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其不同组织中的乳酸脱氢酶（LDH）和苹果酸脱氢酶（MDH），以从形态特征和生化遗传层面丰富美洲鲥种质资源研究内容，同时为筛选出鉴定美洲鲥种质的生化遗传标记打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试美洲鲥于2017年3和5月分别采自江苏南通和湖北宜昌两地，前者为工厂化水泥池养殖，后者为网箱养殖，共40尾，体重126.3～958.5 g/尾，体长21.3～33.8 cm/尾。

1. 2 形态测定

按照GB/T 18654.3—2008《养殖鱼类种质检验》中的相关规定，用游标卡尺（精确度0.1 mm）对样本鱼进行测定。其中，可数性状包括背鳍、臀鳍、胸鳍、腹鳍和尾鳍的鳍式、纵列鳞及左侧第一鳃弓外侧鳃耙数，可量性状包括体长、体高、头长、吻长、眼径、眼间距、尾柄长和尾柄高。

1. 3 组织酶液制备

参照贺刚等（2012）的方法制备组织酶液。用剪刀剪除鳃部后置于水中放血，冰浴条件下趁鱼体尚存活时采集心脏、眼睛晶状体、肌肉、肝脏、肾脏和鳃组织，各组织经预冷的生理盐水冲洗干净后置于低温冰箱（-80 ℃）保存备用；或将样品称重后放入洗净预冷的匀浆器内，按1∶3（g/mL）加入预冷双蒸水，冰浴条件下反复研磨至浆状，4 ℃下12000 r/min离心30 min ，重复3次，收集上清液，分装后-80 ℃保存备用。

1. 4 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，其分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度3.0%，电极缓冲液为pH 8.3的Tris甘氨酸。电泳采用稳压方式（220 V）电泳5 h。

1. 5 染色

电泳结束后取出凝胶板，室温下避光染色，其中，LDH染色参照余来宁等（2014）的方法，MDH染色参照孟彦等（2009）的方法。待出现清晰条带后用去离子水漂洗凝胶板2～3次，然后将凝胶板平置于自制灯箱上用尼康数码相机进行拍照。

1. 6 统计分析

所测得的可量性状数据采用SPSS 20.0进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 美洲鲥的形态特征

美洲鲥体侧扁，呈纺锤形，背、腹缘呈浅弧形，背部灰黑色，略带蓝绿色金属光泽，体侧和腹部均为银白色（图1）。头部无鳞，呈三角形；口中等大，口裂倾斜，向后延伸至眼后缘下方，下颌与上颌等长或下颌略有突出；眼中等大小，距吻端较近，脂眼睑发达，遮盖眼的一半。美洲鲥的背鳍基部较短，位于体中部稍前方，起点在腹鳍起点稍前方，背鳍鳍式D.iii-13～15；胸鳍向后但未伸达腹鳍起点，胸鳍鳍式P.i-14～17；腹鳍起点在背鳍下方稍后，向后，也未伸达臀鳍起点，腹鳍鳍式V.i-7～9；臀鳍基部稍长于背鳍基部，臀鳍鳍式A.i～ii-16～20；尾鳍深叉形，尾鳍鳍式C.21～25。鱼体被覆薄圆鳞，腹部具棱鳞，尾鳍基部有小鳞片覆盖，鳞片极易脱落。

美洲鲥的上颌两侧各具一列绒毛状微齿，正中具倒V字形缺刻，缺刻处无齿；下颌无齿；舌近三角形，无色、微透明；具咽齿；鳃耙呈近7字型，左侧第一鳃弓外侧鳃耙数24～37+47～64。鳔2室，呈长梭形，有鳔管。脊椎骨数51～57。美洲鲥的可数性状及可量性状详见表1。

2. 2 美洲鲥LDH的表达情况

美洲鲥LDH的表达情况如图2所示。将靠近阳极（+）最近的一条酶带定义为LDH1，自阳极向阴极（-）方向依次编号（LDH1、LDH2、LDH3…）。根据各LDH酶带活性及自阴极向阳极的迁移距离，在凝胶板右侧绘制模式图，其中LDH1、LDH2、LDH3…

LDH6分别对应左边凝胶板上的相应酶带。不同组织中的LDH酶带数目及其活性各不相同，存在明显的组织特异性。其中，从心脏中共检测到6条酶带，以LDH1～LDH3活性较强，LDH5活性最弱，除4号鱼未检测到LDH6酶带外其余样本鱼的酶带条数相同（图2-A）；从眼睛晶状体中共检测到6条酶带，4尾样本鱼的酶带条数及其活性各不相同，LDH1、LDH3、LDH4、LDH5和LDH6为共有酶带，LDH2只在1号鱼中被检出（图2-B）；从肌肉中共检测到6条酶带，4尾样本鱼的酶带数及其活性相同（图2-C）；从肝脏中共检测到5条酶带，4尾样本鱼的酶带数相同，但其活性存在差异，以4号鱼的LDH3活性最强，LDH4在4尾样本鱼中的活性均较弱（图2-D）；从肾脏中共检测到5条酶带，以LDH1和LDH3的活性较强，4尾样本鱼的酶带数完全相同（图2-E）；从鳃组织中也检测到5条酶带，所有样本鱼的酶带数及其活性相同（图2-F）。

2. 3 美洲鲥MDH的表达情况

美洲鲥MDH的表达情况如图3所示。将靠近阳极最近的一条带定义为m-MDH1，自阳极向阴极方向依次编号（m-MDH1、m-MDH2、m-MDH3…）。根据各MDH酶带活性及自阴极向阳极的迁移距离，在凝胶板右边绘制模式图，其中m-MDH1、m-MDH2、m-MDH3和m-MDH4分别对应左边凝胶板上的相应酶带。不同组织中的MDH酶带数目及其活性各不相同，也呈明顯的组织特异性。其中，从心脏中共检测到3条酶带，4尾样本鱼的酶带数相同，但以m-MDH3活性最强、m-MDH1活性最弱（图3-A）；相对于其他组织，所有样本鱼的眼睛晶状体中MDH酶带活性较弱，仅检测到2条酶带，且m-MDH2的活性相对于m-MDH1更弱（图3-B）；从肌肉中共检测到3条酶带，m-MDH2和m-MDH3为共有酶带，1号鱼和4号鱼的带型相同，2号鱼和3号鱼的带型相同（图3-C）；从肝脏中共检测到4条酶带，m-MDH3和m-MDH4为共有酶带，且以m-MDH4活性最强，1号鱼未检测出m-MDH1和m-MDH2，其余3尾鱼均检测到4条酶带（图3-D）；从肾脏中共检测到3条酶带，m-MDH2和m-MDH3为共有酶带，m-MDH3活性最强，除1号鱼外其余3尾样本鱼均检测到m-MDH1酶带（图3-E）；从鳃组织共检测到2条酶带，除4号鱼外其余3尾样本鱼的2条MDH酶带活性均较强（图3-F）。

2. 4 美洲鲥生化遗传标记的确定

综合上述研究结果可知，4尾样本鱼的肌肉、肝脏和肾脏中MDH酶带均呈多态性，心脏和眼睛晶状体中MDH酶带数相同，但心脏MDH有明显的拖带现象，眼睛晶状体MDH活性存在个体差异。相对于美洲鲥MDH而言，其LDH分离效果更优，心脏和眼睛晶状体中LDH酶带存在多态性，肝脏LDH活性存在个体差异，而肌肉和肾脏中LDH有明显的拖带现象，均不适宜作为鉴定美洲鲥种质的生化遗传标记。鳃组织中LDH酶带相对清晰，且无多态性和拖带现象。随机选取两个采样点、不同规格的10尾样本鱼鳃组织进行LDH同工酶分析，结果发现所有样本鱼的鳃LDH酶带均呈单态，即不存在个体差异，且各酶带分离清晰（图4），因此建议选取鳃LDH作为鉴定美洲鲥种质的生化遗传标记。

3 讨论

通过与已有文献关于美洲鲥形态特征的比较，发现本研究结果与其存在以下不同之处。①头长/眼径：杜浩和危起伟（2004）、洪孝友等（2011a）的研究及本研究中美洲鲥的头长/眼径分别为3.13～3.70、4.83～5.43和4.98～5.60；②头长/眼间距：三者依次分别为4.54～5.62、3.63～4.35和3.15～3.55；③体长/头长：洪孝友等（2011a）的研究与本研究中美洲鲥的体长/头长分别为4.05～4.33和4.36～4.76；④第一外鳃弓鳃耙数：杜浩和危起伟（2004）、刘金兰等（2008）、洪孝友等（2011a）的研究及本研究中美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为：59～73、24～31+47～55、27+44和24～37+47～64。造成可量性状差异的原因除了与样本量有关外，还可能与测量方法有关，如可量性状参数的起止点界定，不同研究者可能界定点不同。与大多数鱼类不同，美洲鲥的鳃耙呈近7字形，本研究计数美洲鲥第一外鳃弓鳃耙数时以拐点为分界，分别计数两段的鳃耙数，再以“+”连接表示，与刘金兰等（2008）、洪孝友等（2011a）的表示方法一致。

本研究发现，在美洲鲥的各组织中均能检测到LDH酶带，说明美洲鲥体内LDH分布较广泛。LDH在美洲鲥组织中的表达具有组织特异性，如LDH在美洲鲥肌肉中共检测到6条酶带，而在肾脏中仅检测到5条酶带，且在肌肉中任何一条LDH酶带的活性均较强。同工酶是基因表达的产物，但其表达受温度、压力、激素、氧容量和营养等因素的时空调控，致使同工酶在各组织间是否同时表达及表达强弱均不相同，进而造成不同组织同工酶酶谱特异性（龙华等，2000）。此外，同工酶表达与组织器官的代谢相关联。LDH是糖酵解过程中的一种重要酶，能可逆地使乳酸与丙酮酸间相互转化（余敏等，2006）。肌肉组织的主要功能是运动，即分解糖类物质而产生能量以供肌肉完成运动，说明本研究中美洲鲥肌肉组织LDH6表达格外强烈与肌肉的运动功能密切相关。MDH是生物糖代谢的关键酶之一，参与三羧酸循环过程，在葡萄糖异生或糖酵解过程中发挥重要作用（林文燕等，2010）。本研究中，MDH也表现出组织特异性，如在美洲鲥的肝脏中共检测到4条酶带，且m-MDH4活性较强；在眼睛晶状体中仅检测到2条酶带，活性均较弱，故推测MDH与肝脏的重要生理功能有关。本研究还发现，在美洲鲥各组织中均未检测到s-MDH酶带，可能是由于美洲鲥MDH的特殊性或该类型酶带表达太弱未检出，但具体原因有待进一步探究。

同工酶制备及电泳方法直接关系到生化遗传特性的分析结果，因此有必要对各操作细节进行探讨优化。同工酶制备的每一环节都直接影响电泳的效果，为了得到理想的同工酶图谱，操作过程需格外注意。影响同工酶最主要的因素是温度，整个试验过程应尽量保持低温，防止温度升高致使酶失活。采集组织样品及匀浆时均需要在冰浴条件下或相当于冰浴条件下进行；酶液提取可在4 ℃冰箱中完成；组织离心也必须处于低温状态，一般在4 ℃下离心，具体离心时间和次数依不同组织及具体试验要求而定；样品短时间保存可置于4 ℃冰箱，长期保存则须放进超低温冰箱或液氮中；电泳时电泳槽可置于4 ℃冰箱中或在循环水冷却系统条件下进行。此外，组织样品的采集不能受其他种组织或个体的污染，故采集组织样品后须以预冷的生理盐水洗去血污，采集不同组织或个体时手术器械必须洗净，避免交叉污染。pH对同工酶的电泳也特别重要，无论是凝胶缓冲液还是电极缓冲液都需要调整pH，有时可考虑上槽和下槽使用不同pH的缓冲液，以期获得更好的分離效果。进行同工酶染色时，不同同工酶需要选择不同底物，显带时间与染色温度及同工酶类型有关，染色过程中尽量避光并置于摇床上进行，促使染色均匀。若是不同组织在同一凝胶板中染色，则需要根据同工酶类型调整好上样量或依据组织类型不同将凝胶切割后分开染色。

4 结论

美洲鲥同工酶表达的组织特异性受遗传基因调控，同时与各器官组织的生化代谢活动相关。实际生产中，建议选取鳃LDH作为鉴定美洲鲥种质的生化遗传标记。

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（责任编辑 兰宗宝）