玉米须总皂苷通过调节炎性反应因子TNF—α和IL—6改善2型糖尿病大鼠脂代谢

余渊 程杰

摘要 目的：探讨分析玉米须总皂苷（Saponin Extracted from Zea Mays L，ZMLS）对高脂饮食加链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）诱导的2型糖尿病大鼠脂代谢的影响，以为临床中本病的治疗提供理论基础。方法：60只雄性SD大鼠随机分为正常组，2型糖尿病组以及玉米须总皂苷观察组，每组20只，2型糖尿病模型建立成功后，玉米须总皂苷观察组给予玉米须总皂苷4 mg/（kg·d）灌胃治疗，正常组和2型糖尿病组给生理盐水灌胃比较，治疗4周和8周后处死大鼠各半，HE染色检测肝脏脂肪蓄积特点，试剂盒检测血脂和抗氧化指标，RT-PCR和Western Blot检测肝脏TNF-α和IL-6表达特点。结果：HE染色可见，与正常组比较，模型组有明显脂肪空泡，提示2型糖尿病大鼠有明显的肝脏脂肪代谢异常，玉米须总皂苷治疗后，其脂肪空泡明显减少；与正常组比较，模型组血糖、血脂TG、氧化因子MDA明显升高（P<0.05），胰岛素、血脂HDL-C和抗氧化指标SOD明显下降（P<0.05），玉米须总皂苷治疗4周后，TG和MDA明显下降（P<0.05），HDL-C和SOD明顯升高（P<0.05），治疗8周后进一步改善（P<0.05）；RT-PCR和Western Blot可见与正常组比较，模型组TNF-α和IL-6表达明显升高（P<0.05），治疗4周后有一定降低，但改善并不明显，治疗8周后均明显降低（P<0.05）。结论：玉米须总皂苷对2型糖尿病大鼠脂代谢具有明显的调节作用，作用机制可能与其可调节TNF-α和IL-6表达有关。

关键词 玉米须总皂苷；肿瘤坏死因子-α；白介素-6；2型糖尿病；大鼠

Abstract Objective：To study the effects of Zea mays L.saponin （ZMLS） on type 2 diabetes rats induced by high fat diet and Streptozocin （STZ），which provided a fundamental basis for the treatment of the disease.Methods：A total of 60 male SD rats were randomly divided into normal group，type 2 diabetes group （model groups），and ZMLS group，with 20 cases in each group.Rats in ZMLS group were given ZMLS 4 mg/kg/day by gavage treatment，rats in normal group and model group were given physiological saline by gavage.After treatment for 4 weeks and 8 weeks，half of the rats were sacrificed，HE staining was used to detect the Liver fat accumulation characteristics，and lipid and antioxidant indexes were detected by the kit.The expression of TNF-α and IL-6 in liver tissue were detected by RT-PCR and Western Blot.Results：HE staining showed that there were obvious fat vacuoles in the model group compared with the normal group，which showed an obvious abnormality of liver fat metabolism in type 2 diabetes rats.After treatment，the fat vacuoles decreased significantly.Compared with the normal group，the blood sugar，TG and MDA in the model group were significantly increased （P<0.05）； insulin，HDL-C and SOD were decreased （P<0.05）.After 4 weeks of ZMLS treatment，the levels of TG and MDA were significantly decreased （P<0.05） and the levels of insulin，HDL-C and SOD were significantly increased （P<0.05），which further improved after 8 weeks of treatment （P<0.05）； Compared with the normal group by RT-PCR and Western Blot，the expression of TNF-α and IL-6 in the model group was significantly increased （P<0.05） and then decreased after 4 weeks treatment，but the improvement was not obvious.After 8 weeks of treatment，all the indexes significantly reduced （P<0.05）.Conclusion：ZMLS can significantly regulate blood lipid of rats with type 2 diabetes，which maybe related with its regulating function of the expression of TNF-α and IL-6.

Key Words Zea mays L.saponin （ZMLS）； Tumor Necrosis Factor-α； InterLeukin-6； Type 2 Diabetes； Rat

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.042

当前2型糖尿病是最为流行的一种糖代谢疾病，近年来随着人们生活水平的提高，本病发病率逐年升高。最新研究显示，目前我国2型糖尿病患者高达1亿人，已经成为威胁人们健康的一大疾病[1-2]。本病初期症状不典型，多通过体检发现，因此容易被人们忽视，而一旦发现多数已经成为中晚期糖尿病，因此关注和研究本病具有十分重要的意义[3-4]。玉米须总皂苷是从玉米须中提取的一类皂苷类化合物，关于玉米须或玉米须总皂苷等对2型糖尿病的作用目前已有文献报道[5-6]，但是关于其对2型糖尿病脂代谢的影响还没有研究报道，因此本次研究着眼于此，采用高脂饮食+STZ建立2型糖尿病大鼠模型，观察玉米须总皂苷是否有降脂作用，以及其是否对肝脏肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白介素-6（InterLeukin-6，IL-6）是否有改善作用，以为临床本药的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级SD（Sprague Dawley）雄性大鼠60只，6周龄，体质量为180～220 g，所有大鼠均购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，大鼠合格证号为：SCXK（鄂）2011-0007。大鼠饲养和造模用基础饲料、高脂饲料和饲养用垫料均购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，基础饲料配方为：碳水化合物60%、蛋白质22%、粗纤维4.6%、脂肪3.4%、其他10.0%；高脂饲料为：基础饲料66.5%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸钠1%。

1.1.2 药物 玉米须总皂苷由华中科技大学同济医学院药学院提供（纯度98%）。

1.1.3 试剂与仪器 血糖、胰岛素、丙二醛（MDA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，SOD试剂盒购物武汉博尔德生物公司；戊巴比妥钠，TNF-α和IL-6多克隆抗体、单克隆抗体b-actin购于美国Santa Cruz公司、抗体稀释液、二抗、PV-6002和DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，多聚甲醛购于上海化学试剂有限公司。显微镜（日本Olympus光学公司）。LEICA RM 2025型病理组织切片机（德国Leica公司）。PHY-H型病理组织漂烘处理仪（常州市中威电子仪器有限公司）。HH.W21.Cu600型电热恒温水浴箱（上海市百典仪器厂）、FA2104型电子天平（上海右一仪器有限公司）。紫外可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）。AMR-100型酶标仪（杭州奥盛生物公司）。Bio-rad蛋白电泳仪（伯乐生命医学产品（上海）有限公司）。Applied Biosystems pcr仪（赛默飞世尔中国）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备造模方法 60只大鼠在购买后均要求適应性喂养10 d，之后按照随机数字法分为正常组，模型组，以及玉米须总皂苷观察组，每组分别为20只，10 d后模型组和玉米须总皂苷观察组给予高脂高糖饮食4周+一次性STZ注射建立2型糖尿病大鼠模型，2型糖尿病大鼠模型的建立标准为血糖检测连续7 d均>15.6 mmol/L。

1.2.2 干预方法 模型建立成功后玉米须总皂苷观察组给予玉米须总皂苷4 mg/kg·d灌胃治疗，正常组和模型组只给予生理盐水灌胃治疗，分别于治疗4周后和8周后处死大鼠各半进行以下实验。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肝脏组织和血液的收集 使用3%戊巴比妥钠3 mL腹腔注射麻醉大鼠，大鼠麻醉后将其固定于解剖台，之后立即沿腹中线切开腹腔，掏出肝脏，最后统一取肝左叶置于4%中性福尔马林溶液中固定，其余置于超低温冰箱保存备用。完成上述后，小心剖开胸腔，用10 mL注射器沿腹中线取血，低温离心机4 000 r/min离心15 min后，取上清液分装于1.5 mL离心管中保存备用即可。

1.2.3.2 HE染色 将肝脏组织从4%的福尔马林中取出，脱水、石蜡包埋、切片、最后进行HE染色，染色后中性树脂封片，显微镜下观察结果。

1.2.3.3 RT-PCR法检测TNF-a和IL-6 mRNA表达 采用天根总RNA提取试剂盒提取肝脏中总RNA，提取完成后取2 μg RNA进行逆转录，逆转率完成后扩增，扩增条件如下：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后给予72 ℃总延伸5 min。完成后，每组各取5 μL PCR产物，0.5%的琼脂糖电泳，电泳完成后，凝胶成像仪采集图像，Image J计算每个条带荧光强度值，每组实验重复3次。引物序列见表1。

1.2.3.4 Western blotting检测TNF-a和IL-6蛋白表达 总蛋白提取液提取总蛋白后，每组各取60 μg用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。电泳完成后立即转移蛋白到PVDF膜（半干转移法），转移完成后3%脱脂牛奶封闭2 h，完成后加入相应1抗，（1∶2 000）封闭袋中摇床1 h，之后至于4 ℃冰箱中过夜孵育；次日，洗涤3次后，加入相应二抗（1∶5 000）孵育2 h、洗涤3次后，立即进行化学发光法曝光，之后压片。凝胶图像分析系统检测蛋白质印迹条带灰度，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法 统计学处理采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠一般情况 全程可见正常组大鼠活泼好动，毛发发白，饮食和饮水均正常，模型组大鼠则有明显的饮食和饮水增加，但是精神和空白组差别不大，主要不同为毛色发黄，同时明显消瘦，观察组大鼠间于正常组与模型组之间。

2.2 HE染色 HE染色可见正常组大鼠肝脏肝细胞结构纹理清晰，均以中央静脉放射状排列。模型组则表现有明显的肝小叶结构破坏，同时肝细胞明显肿大，此外肝组织有大量的脂肪空泡和脂肪变性；玉米须总皂苷治疗4周后，其肝细胞仍有一定的肿胀和脂肪变性，治疗8周后则有明显的好转，只有较少的脂肪空泡，肝细胞大小也基本恢复到正常。见图1。

2.3 血糖和胰岛素水平 与正常组比较，模型组空腹血糖（FBG）明显升高（P<0.05），FINS（空腹胰岛素水平）明显降低（P<0.05），玉米须总皂苷治疗4周后，空腹血糖含量明显降低（P<0.05），胰岛素水平明显升高（P<0.05），治疗8周后FBG进一步降低（P<0.05），FINS进一步升高（P<0.05）。见表2。

2.3 血脂水平变化 与正常组比较，模型组TG含量明显升高（P<0.05），HDL-C含量明显降低（P<0.05），玉米须总皂苷治疗4周后，TG含量明显下降（P<0.05），HDL-C含量明显升高（P<0.05），治疗8周后进一步改善。见表3。

2.4 大鼠氧化和抗氧化能力的变化 与正常组比较，模型组SOD明显下降（P<0.05），MDA含量明显升高（P<0.05），玉米须总皂苷治疗4周后，SOD明显升高，MDA含量明显降低，治疗8周后进一步改善（P<0.05）。见表4。

2.5 蛋白表达 与正常组比较，模型组IL-6和TNF-a蛋白表达明显升高（P<0.05），玉米须总皂苷治疗4周后，其含量明显有一定程度的下降，但差异无统计学意义，治疗8周后则明显下降（P<0.05）。见图2，表5。

2.6 mRNA表达 与正常组比较，模型组IL-6和TNF-a mRNA表达明显升高（P<0.05），玉米须总皂苷治疗4周后，其含量明显有一定程度的下降，但差异无统计学意义，治疗8周后则明显下降（P<0.05）。见图3，表6。

3 讨论

2型糖尿病脂代谢异常是造成2型糖尿病并发症的危害之一，特别是2型糖尿病并发动脉硬化[7]。有研究报道2型糖尿病动脉硬化发病率是普通人群的2～4倍[8]，因此关注和研究2型糖尿病脂代谢具有十分积极的意义。一般而言，糖尿病的血脂异常主要包括脂代谢数量和质量的异常，其典型脂谱包括高三酰甘油和低密度脂蛋白血症2个重要方面，对于低密度脂蛋白通过严格控制摄入可较好控制，但是对于高三酰甘油血症调控较难，这主要是由于TG生成除摄入外，自我的调节和合成也是重要的一面，特别是肝脏，肝脏细胞是胰岛素受体分泌较多的地方之一，当血糖升高后，可造成胰岛素抵抗指数的增加，在胰岛素抵抗指数的增加下可造成游离脂肪酸流入肝脏增多，最终造成VLDL的过度合成，VLDL过高可造成机体清除TG发生障碍，最终造成了高三酰甘油血症的发生[9-13]。而三酰甘油的增加，造成了肝脏中脂质的聚集，最终造成肝脏脂肪肝的发生，此外其也会造成血液中TG的增加，引起患者動脉硬化甚至冠心病的发生[14]。

IL-6和TNF-α是目前公认的影响2型糖尿病发生和发展的重要炎性反应因子，IL-6主要由单核巨噬细胞产生，在病理状态下，其他相关细胞也可以产生，其升高可以反应体内炎性反应的状态，还可以引起相应病理损伤，从而参与2型糖尿病的发展[15]。此外，IL-6也可能参与了2型糖尿病相关并发症的形成，其形成机制主要为减少肝脏细胞膜表面葡萄糖转运体-4（GLUT-4）表达，从而降低脂肪细胞对胰岛素的敏感性，最终促进血液中血脂的升高，最终造成动脉硬化甚至冠心病的发生[16]。TNF-α与IL-6稍有不同，TNF-α与免疫调节、炎性反应因子以及促凝血止血等密切相关，其也参与了2型糖尿病患者的发生和发展[17]。在2型糖尿病患者中，由于肝脏细胞长期受到高脂和高糖的浸润，造成了其体内血小板功能和血液循环均发生异常，血小板功能和血液循环障碍的异常，可造成凝血酶异常，进而造成TNF-α的过量分泌，TNF-α的升高可反作用于肝细胞，进而使得肝细胞表面的胰岛素受体底物-1的丝氨酸残基磷酸化，降低了肝细胞对胰岛素的敏感性，最终造成体内糖脂代谢的异常[18-19]。

我国是玉米种植大国，早在古代，就有中医专家采用玉米须来治疗糖尿病的研究，而近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，进一步证实了玉米须的作用，其不仅对降糖，同时对包括降脂特别是降低体内胆固醇具有很好的疗效[20-21]。此外，药学研究还发现，对于降脂，玉米须总皂苷和玉米须多糖都有一定的作用，而其中发挥主要作用的为玉米须总皂苷[22]。本研究用玉米须总皂苷治疗2型糖尿病大鼠，研究结果显示：玉米须总皂苷可明显改善2型糖尿病大鼠肝功能，调节血脂，最终促进肝脏脂肪颗粒的排出，此外RT-PCR以及Western检测肝脏组织中IL-6和TNF-α的表达，结果显示，玉米须总皂苷可以明显降低2型糖尿病IL-6和TNF-α的表达。提示：玉米须总皂苷对2型糖尿病大鼠炎性反应因子有一定的改善作用。

综上所述，玉米须总皂苷可明显改善2型糖尿病血脂，提高抗氧化能力，这与其可以调节TNF-α和IL-6表达有关。

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