金樱子配方颗粒提取工艺优化及质量标准、指纹图谱研究

尚莹莹 胡辉 刘源才

摘 要 目的：優化金樱子配方颗粒的提取工艺，并初步建立该配方颗粒的质量标准及指纹图谱。方法：以金樱子药材出膏率和金樱子多糖提取率为指标，以提取次数、加水量和提取时间为因素，采用正交试验设计优化金樱子配方颗粒的提取工艺并进行验证试验。采用薄层色谱法（TLC）对金樱子配方颗粒进行定性鉴别；采用紫外分光光度法（UV）对金樱子配方颗粒中的金樱子多糖（以D-无水葡萄糖计）进行含量测定。采用高效液相色谱法（HPLC）建立金樱子配方颗粒的指纹图谱；以8号峰为参照，绘制10批金樱子配方颗粒样品的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行相似度评价，确定共有峰。结果：优选提取工艺为8倍量水，回流提取2次，每次2 h；金樱子药材平均出膏率为51.07%（RSD=0.58%，n=3）、金樱子多糖平均提取率为22.17%（RSD=0.58%，n=3）。金樱子配方颗粒样品TLC图斑点清晰，分离度好。UV法测定D-无水葡萄糖检测质量浓度线性范围为0.010 8～0.054 2 mg/mL（r=0.999 1）；金樱子多糖定量限为0.070 3 mg，检测限为0.014 0 mg；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率为97.3%～100.8%（RSD=1.33%，n=9）。10批金樱子配方颗粒样品的HPLC图谱有8个共有峰，相似度均大于0.937；经验证，该10批金樱子配方颗粒样品的HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。结论：金樱子配方颗粒的优化提取工艺稳定、可行；所建的指纹图谱可为金樱子配方颗粒的质量评价提供依据。

关键词 金樱子；配方颗粒；提取工艺；正交试验；薄层色谱法；紫外分光光度法；高效液相色谱法；含量测定；指纹图谱

中图分类号 R944；R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）14-1922-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.12

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the extraction technology and establish the quality standard and fingerprint of Rosa laevigata formula granules primarily. METHODS： Using the yield of extract and extract rate of R. laevigata polysaccharide as index， the extraction technology of R. laevigata formula granules was optimized by orthogonal test with water amount， extraction times and extracting time as factors. Validation test was also conducted. TLC was used to identity R. laevigata formula granule qualitatively. The content of R. laevigata polysaccharide （by D-glucosum anhydricum） in R. laevigata formula granules was determined quantitatively by UV spectrophotometry. HPLC method was adopted to establish the fingerprint of R. laevigata formula granules. Using No. 8 peak as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of R. laevigata formula granules were drawn. The similarity of samples was evaluated by using TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition） to determine common peak. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows as 8-fold water， extracting for 2 times， 2 h each time. The average yield was 51.07% （RSD=0.58%，n=3） and the average extraction rate of polysaccharide in R. laevigata was 22.17% （RSD=0.58%，n=3）. TLC spots of R. laevigata formula granules were clear and well-separated. In UV test， the linear range of D-glucosum anhydricum were 0.010 8-0.054 2 mg/mL （r=0.999 1）， respectively； for R. laevigata polysaccharide， the limit of quantitation was 0.070 3 mg， and the limit of detection was 0.014 0 mg； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 2%； average recoveries were 97.3%-100.8% （RSD=1.33%，n=9）. There were 8 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples， and the similarity was higher than 0.937. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of sample had good consistency with reference fingerprints. CONCLUSIONS： The optimized extraction technology of R. laevigata formula granules is stable. Established fingerprint can provide reference for quality evaluation of R. laevigata formula granules.

KEYWORDS Rosa laevigata； Formula granules； Extraction technology； Orthogonal test； TLC； UV spectrophotometry； HPLC； Content determination； Fingerprint

金樱子为蔷薇科植物金樱子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果实。2015年版《中国药典》（一部）将金樱子收载为常用中药，其具有固精缩尿、固崩止带、涩肠止泻等功效[1]，临床常用于治疗上呼吸道感染、烧伤、直肠脱垂及各种妇科疾病[2]。金樱子富含多糖、黄酮及鞣质等多种化学成分[3-6]。中药配方颗粒是对传统中药材应用形式的重大突破，其以生产自动化、生产条件恒定等特点，既符合中医辨证论治原则，又具有免煎易服、质量稳定等优点[7-9]。本研究优化了金樱子配方颗粒的提取工艺，并采用薄层色谱法（TLC）对金樱子配方颗粒进行定性鉴别，采用紫外分光光度法（UV）对金樱子饮片、提取物、配方颗粒中的金樱子多糖（以D-无水葡萄糖计）进行含量测定，同时，采用高效液相色谱法（HPLC）建立了金樱子配方颗粒的指纹图谱，旨在为该配方颗粒的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

U3000型HPLC仪，包括LPG-3400SDN四元梯度泵、WPS-3000SL自动进样器、TCC-3000RS柱温箱、VWD-3100及DAD-3000检测器（德国Thermo Fisher公司）；T9型UV仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；SK8200LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；XMTD-7000型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；AB135-S型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；ELGA Option-Q型纯水机[威立雅水处理技术（上海）有限公司]。

1.2 药品与试剂

金樱子配方颗粒（劲牌生物医药有限公司，批号： P20161115、P20161116、P20161117、P20161118、P20161119、P20161121、P20161123、P20161124、P20161126、P20161127，规格：2.6 g/袋，每1 g金樱子配方颗粒相当于3.8 g金樱子中药饮片）；金樱子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121047-201204）；D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201506，纯度：99.9%）；麦芽糊精（西王药业有限公司，批号：F160305004）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

金樱子药材（湖北正光九资河药业有限公司，批号：160601），经中南民族大学药学院梅之南教授鉴定为蔷薇科植物金樱子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 金樱子配方颗粒提取工艺优化

2.1.1 正交试验因素与水平 参考《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》[10]中的规定，以提取次数（A）、加水量（B）和提取时间（C）为因素，以金樱子药材出膏率和金樱子多糖提取率为指标，每个因素取3个不同水平，采用L9（34）正交试验设计进行考察。因素与水平见表1。

2.1.2 正交试验结果与分析 称取金樱子药材20 g，共9份，按“2.4”项下UV法测定金樱子多糖的含量，并计算金樱子药材出膏率和金樱子多糖提取率。金樱子药材出膏率（%）=干膏粉质量（g）/提取用生药质量（g）×100%；金樱子多糖提取率（%）=干膏粉质量（g）×金樱子多糖含量（%）/提取用生药质量（g）×100%，或金樱子多糖提取率（%）=金樱子药材出膏率（%）×金樱子多糖含量（%）。正交试验设计与结果见表2。采用方差分析方法对金樱子多糖提取率进行分析，结果见表3。

2.1.3 优选的提取工艺 由方差分析結果可知，影响金樱子多糖提取率的因素影响程度依次为C>A>B，其中因素C有显著影响，即提取时间是影响该工艺的最重要因素。从省时降耗及生产实际出发，在保证提取充分的前提下，综合分析各个因素的影响，拟定优选提取工艺为A2B1C3，即8倍量水，回流提取2次，每次2 h。

2.1.4 优选提取工艺的验证试验 称取金樱子药材200 g，按优选提取工艺重复验证3次，测得金樱子药材平均出膏率为51.07%，RSD为0.58%（n=3）；金樱子多糖平均提取率为22.17%，RSD为0.58%（n=3），表明该优选工艺可靠，结果见表4。

2.2 金樱子配方颗粒的制备

以优选的提取工艺，精密称取金樱子药材2 kg，共10份，分别加入8倍量水，回流提取2次，每次2 h；合并提取液，滤过，滤液蒸干得金樱子浸膏；加8%麦芽糊精，干法（挤压制粒法）制粒，干燥，得金樱子配方颗粒。

2.3 金樱子配方颗粒的定性鉴别

精密称取金樱子配方颗粒样品（批号：P20161115）粉末2 g，加乙醇30 mL，超声（功率：500 W，频率：53 kHz，下同）处理30 min，滤过；滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL；合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取金樱子对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。以甲醇溶液作为阴性对照溶液。按照2015年版《中国药典》（四部）TLC法[10-11]试验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（5 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃下加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，详见图1。

2.4 UV法测定金樱子配方颗粒中金樱子多糖的含量

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取于105 ℃下干燥至恒质量的D-无水葡萄糖对照品10.84 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，搖匀，即得质量浓度为1.084 mg/mL的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 取金樱子配方颗粒样品粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加水50 mL，称定质量，静置1 h，加热回流1 h，放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取25 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 检测波长的选择 以4%苯酚-硫酸为空白，取“2.4.1”项下对照品溶液适量，于200～800 nm波长范围内扫描，结果最大吸收波长为490 nm，详见图2。

2.4.4 线性关系考察 分别精密量取“2.3.1”项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得系列对照品贮备液。分别精密量取上述系列对照品贮备液2 mL，置于具塞试管中，加4%苯酚溶液1 mL，混匀，后迅速精密加入硫酸7 mL，摇匀，置于40 ℃水浴中保温30 min，取出，置于冰水浴中放置5 min，得系列线性工作溶液。分别精密吸取上述系列线性工作溶液适量，于490 nm波长处测定吸光度。以D-无水葡萄糖质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得D-无水葡萄糖的回归方程为y=10.325x+0.146 4（r=0.999 1）。结果表明，D-无水葡萄糖检测质量浓度线性范围为0.010 8～0.054 2 mg/mL。

2.4.5 定量限与检测限考察 精密吸取“2.4.1”项下对照品溶液适量，于490 nm波长处测定吸光度。分别按信噪比为10 ∶ 1、3 ∶ 1计算定量限、检测限。结果，金樱子多糖的定量限为0.070 3 mg，检测限为0.014 0 mg。

2.4.6 精密度试验 取“2.4.1”项下对照品溶液适量，置于具塞试管中，按“2.4.4”项下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波长处连续测定6次吸光度。结果，金樱子多糖吸光度的RSD为1.21%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 精密吸取“2.4.2”项下供试品溶液（批号： P20161115）2 mL，共6份，置于25 mL具塞比色管中，按“2.4.4”项下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，分别于显色0、2、4、8、12、24 h后于490 nm波长处测定吸光度。结果，金樱子多糖吸光度的RSD为1.03%（n=6），表明供试品溶液经显色后24 h内的稳定性良好。

2.4.8 重复性试验 取金樱子配方颗粒样品（批号： P20161115）粉末共6份，每份0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取2 mL，置于具塞锥形瓶中，再按“2.4.4”项下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波长处测定吸光度。结果，金樱子多糖吸光度的RSD为1.60%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验 取金樱子配方颗粒样品（批号： P20161115）粉末共9份，每份0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，加入一定量的对照品溶液。分别精密量取2 mL，置于具塞试管中，按“2.4.4”项下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率，结果见表5。

2.4.10 样品含量测定 取10批金樱子配方颗粒样品各适量，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密量取2 mL，置于具塞试管中，按“2.4.4”项下自“加4%苯酚溶液1 mL”起至“置于冰水浴中放置5 min”依法操作，于490 nm波长处测定吸光度，平行测定3次，计算样品含量，结果见表6。含量限度按测定结果平均值的80%计算，得金樱子多糖含量不得少于34.73%。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Thermo C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表7）；检测波长：270 nm；进样量：10 ?L；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min[11-14]。

2.5.2 供试品溶液的制备 取金樱子配方颗粒样品粉末约0.1 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加20%甲醇超声溶解30 min并定容，混匀，经0.22 ?m针头过滤器滤过，即得。

2.5.3 精密度试验 取“2.5.2”项下供试品溶液（批号：P20161116）适量，按“2.5.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以8号峰为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，8个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取“2.5.2”项下供试品溶液（批号：P20161116）共7份，分别于30 ℃下放置1、3、5、7、14、21、28 h时按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，8个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=7），表明供试品溶液于30 ℃下放置28 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取金樱子配方颗粒样品（批号：P20161116）粉末适量，共6份，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，8个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.5.6 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰的相关分析 （1）HPLC指纹图谱的生成。取10批金樱子配方颗粒样品各适量，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对10批金樱子配方颗粒样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图3、图4。

（2）相似度分析。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）以样品HPLC对照指纹图谱为参照，进行整体相似度评价。结果显示，10批样品相似度均大于0.937，表明各批金樱子配方颗粒具有良好的稳定性和特征性，拟定金樱子配方颗粒指纹图谱相似度应不得低于0.900，详见表8。

（3）共有峰的相关分析。10批金樱子配方颗粒样品有8个共有峰，其中8号峰含量最高（但笔者尚未对8号峰的具体成分进行研究），因此选择保留时间为46.732 min的8号峰为参考峰，并计算其他峰相对于8号峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表9、表10。

3 讨论

本研究采用正交试验法对金樱子配方颗粒的提取工艺进行了优化，并确定优选提取工艺为8倍量水，回流提取2次，每次2 h。采用该工艺得到金樱子药材平均出膏率为51.07%，金樱子多糖平均提取率为22.17%，表明该工艺高效、稳定、可靠，可为金樱子配方颗粒的工业化生产提供基础。

本研究参考相关文献[15-16]，采用TLC法对金樱子配方颗粒进行定性鉴别，结果表明，样品TLC图斑点清晰、分离度好。采用UV法对金樱子配方颗粒中的金樱子多糖进行含量测定，结果表明，该方法针对性强、结果准确。另外，本研究建立了金樱子配方颗粒的HPLC指纹图谱，结果10批样品有8个共有峰，相似度均大于0.937，表明样品的HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。

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（收稿日期：2018-02-27 修回日期：2018-05-18）

（编辑：陈 宏）