沼液中添加某些活性成分对交链孢菌的抑制影响

刘继红， 尹 芳， 王昌梅， 赵兴玲， 吴 凯， 柳 静， 杨 红， 刘士清， 张无敌

(云南师范大学， 云南 昆明 650500)

云南红豆杉(TaxusyunnanensisCheng et Lu)又名西南红豆杉，是云南省级珍贵树种，也是云南省一级重点保护树种，是中国生产紫杉醇药物的主要树种[1-3]。研究发现，云南红豆杉根、皮、枝叶中含治癌药物成分紫杉醇等多种治癌药物成分，含量达0.02%。具有防治癌症、白血病等特殊疗效[4]。但目前由交链孢霉属造成的云南红豆杉叶片叶斑病现象日趋普遍，影响了树势生长及药用、观赏价值[5]。

沼液是有机物在进行厌氧消化产生沼气的同时而得到的一种厌氧产物，含有丰富的营养物质，矿物质、水解酶、B族维生素、氨基酸、植物激素、抗生素和腐殖酸等[6]，是一种良好的有机液体肥料，同时又有杀灭或抑制植物病原菌的作用。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试病原菌

实验所用交链孢菌由云南农业大学植物病理重点实验室(该室分离提纯并鉴定的菌株)提供。

1.1.2 培养基

实验室采用常规的PDA培养基[14]。采用马铃薯为培养基，配方为：马铃薯200 g(去皮切成1 cm 左右的正方体小块后煮30 min，过滤取清液用)，葡萄糖25 g，琼脂20 g，加水至1000 mL，不调节pH值。

1.1.3 药品

葡萄糖，琼脂粉，腐殖酸，赤霉素，VB1，VB2，VB6及(NH4)2SO4。

1.1.4 仪器

实验所用主要仪器为：电磁炉、烧杯、玻璃棒、纱布、试管、培养皿、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌打孔器、镊子、接种环和SW-CJ-1F洁净工作台等[14-15]。

1.1.5 供试沼液

取用学校周边青蒿(Artemisiaannua)为发酵原料经过正常发酵后的沼液。

1.2 方法

1.2.1 沼液的处理方法

将不同来源的沼液经12000 rpm离心1 min后取上清液0.5 mL加入已准备好的培养基表面，涂布均匀后做实验组，对照组则加入0.5 mL无菌蒸馏水[14-15]。

1.2.2 活性成分处理方法

(1)依次向以青蒿作为发酵原料的沼液内部添加腐殖酸，调节浓度依次为1%,2%,3%,4%,5%,6%。

(2)依次向以青蒿作为发酵原料的沼液内部添加赤霉素，并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(3)依次向以青蒿作为发酵原料的沼液内部添加VB1，并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(4)依次向以青蒿作为发酵原料的沼液内部添加VB2，并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(5)依次向以青蒿作为发酵原料的沼液内部添加VB6，并调节其浓度为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(6)依次向以青蒿作为发酵原料的沼液内部添加(NH4)2SO4，调节浓度依次为1%,2%,3%,4%,5%,6%。

1.2.3 数据处理方法

抑制菌丝生长率计算采用生长速率法[14-15]。

抑制数(cm)=对照平板培养基上菌落直径-处理平板培养基上菌落直径

抑菌率(%)=

1.2.4 试验方法

(1)将供试菌种接种于PDA平板培养基上培养至长满整个平板，放置备用。

(2)不同浓度活性成分的添加：分别向青蒿沼液中添加腐殖酸，赤霉素，VB1，VB2，VB6及(NH4)2SO4。浓度梯度如下：

含腐殖酸的浓度依次为1%,2%,3%,4%,5%,6%；含赤霉素的浓度依次是0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%；含(NH4)2SO4的浓度依次是1%,2%,3%,4%,5%,6%；含VB1、VB2、VB6的浓度依次是0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。加入预先备有培养基的(φ=9 mm)平板中涂布均匀，2个平行，备用，对照组用无菌蒸馏水[14-15]。

(3)抑菌试验：把调配好的沼液和青蒿原沼液分别采用打孔粘贴法进行抑制交链孢菌的实验，取布满供试交链孢菌的PDA培养基平板，用无菌打孔器(φ=9 mm)取出菌落边缘生长旺盛的菌丝，用镊子小心地将菌种块移入不同抑菌液处理的平板上，菌丝一面朝上，每个培养皿中放入3小块菌种，并呈三角形放于平板中央，加盖并标记，放于25℃恒温培养箱中培养，定时观察测量不用培养基平板上交链孢霉菌的直径[14,15]。

(4)待培养24 h以后，用十字交叉法测量菌块生长的大小。之后每天同一时间再对菌块进行一次测量，一共测量4 d的数据[14-15]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度腐殖酸对沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的沼液里边添加不同浓度的腐殖酸，复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图1所示。

图1 不同浓度腐殖酸与沼液抑菌效果的关系

由图1可以看出，在添加的腐殖酸浓度为1%～2%时，复配液对交链孢菌的抑菌效果弱于青蒿原沼液，而当添加的腐殖酸浓度大于2%时，其复配液的抑菌活性强于青蒿原沼液。当添加的腐殖酸浓度介于3%～6%时，随着病原菌培养时间的增长，青蒿原沼液与复配液之间的抑菌强度差距减小，且当病原菌生长到第4天时，抑菌率都达到了70%。由于腐殖酸对病原菌游动孢子的萌发的抑制效果随浓度的增加而更显著[16]，所以得出：高浓度的腐殖酸对病原菌起到抑制生长的作用，低浓度的腐殖酸反而抑菌效果较差。

2.2 不同浓度的赤霉素对沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的沼液里边添加不同浓度的赤霉素，复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图2所示。

图2 不同浓度赤霉素与沼液抑菌效果的关系

由图2可以看出，当添加的赤霉素浓度在0.1%～0.3%时，复配液对交链孢菌的抑制作用弱于青蒿原沼液，但当添加赤霉素的浓度在0.4%～0.6%时，复配液的抑菌作用强于青蒿原沼液，随着添加赤霉素浓度的不断加大，抑菌效果与原沼液相当。因为赤霉素具有促进细胞分裂和伸长的作用，较低浓度时则表现出刺激病原菌，但浓度较高时则会使细胞死亡。所以可得：高浓度的赤霉素能加强原沼液的抑菌效果，反之低浓度的赤霉素则削弱原沼液的抑菌效果。

2.3 不同浓度的VB1对沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的沼液里边添加不同浓度的VB1，复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图3所示。

图3 不同浓度VB1与沼液抑菌效果的关系

由图3可看出，当添加的VB1的浓度为0.1%时，复配液的抑菌效果强于青蒿原沼液，但是随着添加的VB1浓度的增大，对交链孢菌的抑制作用逐渐减弱。VB1对细胞具有刺激生长的作用，但存在刺激生长的最适浓度0.1%，所以随着添加浓度的不断增大至超过最适浓度，复配液对病原菌的抑制作用不断减弱。由此可以得出：低浓度的VB1对原沼液的抑菌效果有加强的作用，而高浓度的VB1则会削弱青蒿原沼液对交链孢菌的抑制效果。

2.4 不同浓度的VB2对沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的沼液里边添加不同浓度的VB2，复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图4所示。

由图4可以看出，在添加VB2的浓度在0.1%～0.3%时，复配液的抑菌效果显著；但当添加的VB2大于0.3%时，随着VB2浓度的增加，其复配液的抑菌效果趋于平稳。因为VB2对细胞生长代谢起促进作用，但存在促进的最适浓度0.2%，所以在添加浓度不断增大至超过了最适浓度时，对原沼液的抑菌效果影响越来越不显著。由以上得出：VB2能够有效地增加青蒿原沼液的抑菌效果。

图4 不同浓度VB2与沼液抑菌效果的关系

2.5 不同浓度的VB6对沼液抑菌效果的影响

向以青蒿为发酵原料经过正常发酵后的沼液里边添加不同浓度的VB6，复配后对交链孢菌抑菌效果的对比结果如图5所示。

由图5可以看出，当添加VB6的浓度在0.3%时，复配液对交链孢菌的抑制效果强于青蒿原沼液；当添加的VB6浓度增加到0.4%时，复配液的抑制作用弱于青蒿原沼液。VB6在细胞蛋白质的合成和分解代谢中起到促进作用，添加低浓度时促进作用较强，导致原沼液的抑菌效果加强，随着添加浓度的增大，促进作用减弱导致原沼液的抑制效果不显著。由此得出：低浓度的VB6可以增强原沼液的抑菌效果，反之则降低了原沼液的抑菌效果。

2.6 不同浓度的(NH4)2SO4对沼液抑菌效果的影响

图6 不同浓度与沼液抑菌效果的关系

综上可知，在沼液里添加不同浓度的腐殖酸、赤霉素，VB1，VB2，VB6及(NH4)2SO4都对青蒿原沼液抑制交链孢菌有不同程度的影响。各活性成分的最适浓度依次是：3%，0.4%,0.1%,0.4%,0.3%,1%。但是低浓度的VB6对原沼液的抑菌效果没有影响，高浓度的VB6反而削弱了原沼液的抑菌作用。总的来说，青蒿沼液中添加合适浓度的活性成分对抑制交链孢菌具有较好的效果。

3 结论

当沼液中添加的腐殖酸浓度为1%～2%时，其复配液对交链孢菌的抑制效果弱于青蒿原沼液，但添加腐殖酸的浓度介于3%～6%时，复配液对交链孢菌的抑制作用强于青蒿原沼液，并且随着病原菌培养时间的增强，青蒿原沼液与复配液之间的抑菌效果相当，因此，沼液添加腐殖酸的最适浓度为3%。

当沼液中添加的赤霉素浓度为0.1%～0.3%时，其复配液对交链孢菌的抑制效果弱于青蒿原沼液，但是，添加赤霉素浓度介于0.4%～0.6%时，复配液对交链孢菌的抑制作用强于青蒿原沼液，但随着添加的赤霉素浓度的不断增加，青蒿沼液与复配液之间的抑菌效果相当，因此，沼液添加赤霉素的最佳浓度为4%。

当沼液中添加的VB1浓度为0.1%时，其复配液对交链孢菌的抑制效果强于青蒿原沼液，但随着添加的VB1浓度的增加，复配液的抑菌效果有所减弱，因此，沼液添加VB1的最适浓度为0.1%。

当沼液中添加的VB2浓度为0.1%～0.3%时，其复配液对交链孢菌的抑制效果随着添加的VB2的浓度的增加而增强，但添加的VB2的浓度为0.3%～0.6%时，其复配液的抑菌效果与青蒿原沼液的几乎相同，因此，沼液里添加VB2的最适浓度为0.3%。

当沼液中添加的VB6浓度小于0.3%时，其复配液对交链孢菌的抑制效果几乎与青蒿原沼液相当，但添加VB6的浓度大于0.4%时，其复配液的抑菌效果又低于原沼液，因此，低浓度的VB6对青蒿原沼液的抑菌效果几乎无影响，但高浓度的VB6反而会削弱原沼液的抑菌效果。