香樟枝不同极性提取物抗氧化活性研究

高月 ，李子江 ,2，吴磊 ，司传领 *

（1.天津科技大学，天津市制浆造纸重点实验室，天津300457；2.山东商业职业技术学院，山东济南250103；3.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌330096）

香樟（Cinnamomum camphoraPresl.）系樟科樟属常绿乔木，别名樟树、樟木、芳樟、乌樟、油樟等[1-3]，主要分布在热带及亚热带地区，在我国主要分布于长江流域以南，以海南、福建、江西、台湾、湖北等省为主。香樟提取物中富含木脂素、萜类、黄酮类及生物碱类，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性作用，已成为香料、医药、化工产品的重要原料来源[4-9]。目前关于香樟枝抗氧化活性的研究还十分有限，本研究通过常温浸提、分级萃取得到6种不同极性提取物，采用DPPH法[10]和还原能力法[11]两种体外抗氧化活性试验对其抗氧化性能进行评价，旨在为香樟枝抗氧化剂的合成及开发应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香樟枝采集于江西省科学院院内，于阴凉处自然风干，将其干燥至水分≤8%后进行粉碎、过筛，备用。

DPPH购自美国Sigma公司，无水甲醇、无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、浓硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、氯化铁，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

多功能粉碎机，FC-110上海中药机械厂；电子分析天平，CAV4101III，奥豪国际贸易有限公司；超声波清洗器，SK06GT，上海科导超声仪器有限公司；紫外分光光度计，UV-2500，日本；旋转蒸发仪，RE-52A，上海亚荣生化设备仪器有限公司；电热鼓风干燥箱，GG-101BS，天津市天宇仪器实验有限公司；冷冻干燥机，FD-5A-120，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 香樟枝不同极性提取物的制备

称取香樟枝粗粉4.17kg，室温下用90%的乙醇浸提72h，过滤、浓缩后，用悬蒸液（<95%的乙醇）同法再提取两次，合并3次的浓缩液，冷冻干燥得香樟枝醇提物。将部分醇提物分散于水中，用不同极性溶剂进行萃取，依次得到石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及萃取剩余物（水相）。香樟枝醇提物及各萃取物的提取分离流程如图1所示。

图1 香樟枝不同极性提取物萃取、分离过程Fig.1 Extraction and fractionation procedures of different polarextracts fromCinnamomum camphorabranches

1.3.2 香樟枝不同极性提取物溶液的配制

称取香樟树枝醇提物、各萃取相粉末，分别用无水乙醇溶解并稀释到所需浓度。

1.3.3 清除DPPH自由基能力评价

吸取上述不同梯度浓度的待测样品溶液2mL于10mL刻度试管中，依次迅速加入0.06mg/mL DPPH溶液2mL，避光摇匀静置。去离子水代替样品溶液作空白样。室温下避光反应30min后，于517nm波长处测其吸光度值，通过加入自由基清除剂及抗氧化剂吸光度的变化来计算DPPH自由基的清除率，测定2次，并按照上述操作步骤进行3次平行试验。

式中：SADPPH为清除率；A0为以蒸馏水代替样品的空白吸光度；A1为加样反应后反应液的吸光度。

1.3.4 还原能力评价

吸取上述不同浓度梯度的待测样品溶液2.5mL，分别加入2.5mL的磷酸缓冲液（pH6.6）和1%K3[Fe(CN)6]溶液，振摇使其混合均匀。置于50℃恒温水浴中加热20min，冰水浴迅速冷却后，依次加入三氯乙酸溶液2.5mL，摇匀后于3000r/min条件下离心10min。移取上清液1.0mL，加入0.5mL的0.1%FeCl3溶液和7.0mL去离子水摇匀。用紫外分光光度计法在700nm波长处测出其吸光度值，去离子水代替样品溶液作空白样。测定2次，并按照上述操作步骤进行3次平行试验。

2 结果与分析

2.1 香樟枝不同极性提取物的制备得率

香樟枝醇提物、石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相得率如表1所示。

表1 香樟枝不同极性萃取物得率Table 1 Yields of polar different fromcinnamomum camphorabranches

由表1可以看出，香樟枝不同极性提取物得率由大到小依次为醇提物（4.57%）、石油醚萃取物（1.17%）、正丁醇萃取物（1.07%）、乙酸乙酯萃取物（0.79%）、萃取剩余物（0.70%）和二氯甲烷萃取物（0.37%）。香樟枝醇提物经不同极性溶剂萃取后得到石油醚萃取物的含量最高为48.61g，二氯甲烷萃取物的含量最低为15.32g。

2.2 DPPH自由基清除试验

根据自由基清除能力计算公式可得清除率与样品浓度的线性关系。

醇提物浓度（μg/mL）与清除率（%）的线性方程为y=0.0048x+0.0138，R2=0.9968；

石油醚萃取物浓度（μg/mL）与清除率的线性方程为y=0.0011x-0.0153，R2=0.9991；

二氯甲烷萃取物浓度（μg/mL）与清除率的线性方程为 y=0.0019x+0.0549，R2=0.9990；

乙酸乙酯萃取物浓度（μg/mL）与清除率的线性方程为 y=0.0155x+0.0226，R2=0.9923；

正丁醇萃取物浓度（μg/mL）与清除率的线性方程为y=0.0158x+0.0321，R2=0.9949；

水相浓度（mg/mL）与清除率的线性方程为y=0.1496x+0.0485，R2=0.9924。

可见，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物对DPPH自由基的清除效果较好，水相对DPPH自由基的清除效果较弱。

图2 不同浓度的有机萃取相对DPPH自由基的清除活性Fig.2 DPPH scavenging activity of different concentration samples

表2 香樟枝各有机溶剂萃取物清除DPPH自由基的IC50值Table 2 DPPH free radical scavenging activity(IC50)of different soluble fractions fromCinnamomum camphora branches

试验选用二丁基羟基甲苯（BHT）做阳性对照[12]，其中香樟枝不同极性提取物清除DPPH自由基的IC50值如表2所示，IC50值越小，表明实验样品对DPPH自由基的清除效果越显著，抗氧化活性越强；反之抗氧化活性较弱。观察表3可以得出结论：与阳性对照相比，香樟枝不同极性萃取物对DPPH自由基均有一定的清除作用，抗氧化活性成分主要存在于中等极性部分。比较醇提物及各萃取物的IC50值，得出香樟枝乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抗氧化活性明显优于其它萃取物。

2.3 还原能力的评价试验

图2显示了香樟枝不同极性萃取物还原能力的评价结果，由图可以看出，香樟枝不同极性萃取物在一定浓度范围内均具有还原能力，其大小顺序依次为乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、醇提物、二氯甲烷萃取物、石油醚萃取物和水相。同一浓度下的还原能力不同，但一定浓度范围内还原能力的变化趋势具有一致性，随着样品溶液的浓度增大，还原能力增强，即抗氧化活性增强。其中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的还原能力在各个浓度下均较强，表明香樟枝乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中含有大量的还原性物质，即抗氧化活性成分。

图3 香樟枝不同极性提取物还原能力Fig.3 Reducing power of different polar extracts from Cinnamomum camphorabranches

3 结论

两种体外抗氧化试验方法结论几乎一致，香樟枝不同极性提取物中均具有一定的抗氧化活性。在试验浓度范围内，随着浓度的提高，抗氧化能力逐渐增强。不同极性提取物的抗氧化活性具有明显的差异性，中等极性乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物表现出较强的抗氧化活性，清除DPPH自由基和还原Fe3+能力也较强；醇提物和二氯甲烷萃取物的抗氧化能力居中；石油醚萃取物和水相抗氧化活性相对较弱。因此，开发香樟枝抗氧化剂方面的应用具有较为现实的意义，此外可以进一步分离鉴定香樟枝中具有较强抗氧化生物活性的单体成分，为香樟枝抗氧化剂的开发、改性、合成及应用奠定理论基础。