SFOD-LPME-HPLC测定白芷中香豆素类活性成分

李卫霞 于智慧 白小红

白芷，始载于《神农本草经》，系伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana （Boiss.）Shan et Yuan的干燥根[1]。主要产于浙江、河北、河南、四川四大地区[2]。香豆素类如花椒毒酚（Xanthotol）、补骨脂素（Psoralen）、佛手柑内酯（Bergaptene）、欧前胡素（Imperatorin）、异欧前胡素（Isoimperatorin）等，和挥发油类是其主要的活性成分，前者有镇痛的作用，后者具有活血化瘀的作用[3]。白芷具有抗炎[4-5]、诱导血管新生和抗肿瘤等活性[6-7]。目前提取白芷中香豆素成分的方法主要有回流溶剂提取[8]、微波法提取[9]和CO2超临界萃取[10]，这些方法存在操作时间长、富集效果差、设备复杂、溶剂消耗多。

液相微萃取技术（LPME）是Jeannot和Cantwell在20世纪90年代提出的一种新型预处理技术[11]。集萃取、纯化、富集于一体，具有成本低、操作简单快速、溶剂消耗少、富集倍数多等特点。其中，漂浮有机液滴凝固液相微萃取（SFOD-LPME）检测限低、富集倍数高。适合于痕量、低丰度微量[12]天然化合物的分析。

1 材料与仪器

1.1 实验器材

LC-10A高校液相色谱仪（日本岛津，LC-10A液泵，AT-330恒温箱、SPD-10A紫外检测器），色谱柱hypersil ODS2 C18（5μm，250 mm×4.6 mm），85-2数显恒温磁力搅拌器（江苏荣华），8 mm×4 mm磁力搅拌子（博士德科技有限公司），TGL-16M高速冷冻离心机，电子天平。

1.2 对照品和试剂

花椒毒酚（批号：MUST-17031205，纯度≥98%），补骨脂素（批号：MUST-17012215，纯度≥99.99%），佛手柑内酯（批号：A100525，纯度≥98%），欧前胡素（批号：A0011，纯度≥98%），异欧前胡素（批号：A0012，纯度≥98%）均购买自成都曼斯特生物科技有限公司。白芷产地安徽，购自太原市北京同仁堂药店。实验用水为二次蒸馏水，十二醇、盐酸和氯化钠购自天津大茂化学试剂厂，甲醇为分析纯，购自天津四友化工研究所。

2 方法与结果

2.1 色谱分离条件

色谱柱Hypersil ODS2 C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相甲醇：水=70∶30，流速1.0 ml/min，柱温30℃，紫外检测波长300 nm，进样量为20 μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取花椒毒酚、补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素各10 mg，分别置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，制成浓度均为1 mg/ml的储备液，至4℃的冰箱中保存。

再精密量取上述储备液，分别配置浓度为50μg/ml的对照品溶液，于4℃的冰箱中保存。

2.2.2 样品溶液的制备 准确称取每批次白芷药粉各3 g，加30 ml甲醇浸泡2 h，超声提取1 h，加甲醇至30 ml。放于4℃的冰箱中保存，备用。

2.3 操作方法

在10 ml玻璃容器内加入2.2.1项下50 μg/ml对照品溶液各50μl，加水至5 ml，加入适量十二醇，以600 r/min的速度萃取30 min后，静置，至于冰箱中冷冻，待十二醇凝固后，收集十二醇于EP管，在室温下放置成液体后加甲醇，混匀，取20 μl进行HPLC测定。

2.4 条件优化

2.4.1 十二醇用量的选择 比较不同体积萃取剂对萃取的影响，取20、30、40、50、60 μl十二醇分别加入玻璃瓶中，结果如图1，20 μl十二醇的萃取效果最好。

图1 十二醇用量对富集倍数的影响

2.4.2 样品相溶液pH的选择 加酸导致佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的内酯结构发生水解开环，故不再考察pH值。

2.4.3 萃取时间的选择 考察萃取时间为10、20、30、40、50和60 min对萃取效果的影响，结果如图2，综合比较60 min萃取效果最佳。

2.4.4 转速的选择 考察转速为300、600、900、1 200和1 500 r/min时对香豆素类成分的萃取效果的影响，搅拌也可以增加物质的扩散速度，速度过快，十二醇发生乳化，萃取效果下降。结果如图3，600 r/min萃取效果最好。

图2 萃取时间对富集倍数的影响

图3 转速对富集倍数的影响

2.4.5 样品相体积的选择 考察样品相体积为3、4、5、6和7 ml时的萃取效果，结果如图4，选择样品相体积为7 ml。

图4 样品相体积对富集倍数的影响

2.4.6 盐浓度对萃取的影响 本实验考察盐浓度分别为3%、6%、9%、12%、15%和18%（w/v） 时对萃取的影响，结果如图5，15%时萃取效果最佳。

3 方法学考察

3.1 工作曲线和检测限

制成浓度为 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 μg/ml的对照品溶液，依上述实验操作，经HPLC测定后，绘制色谱峰面积y与分析物浓度c之间的线性关系。结果分别为花椒毒酚y=1 161 509c+4 208，R2=0.999 3；补骨脂素y=2 355 213.5c+ 4 649.9，R2=0.998 9；佛手柑内酯y=4 046 730.3c+25 127.5，R2=0.999 1；欧前胡素y=7 431 042.7c+49 857.6，R2=0.999 6；异欧前胡素y=8 129 237c+12 671.9，R2=0.999 5。线性范围均为0.005～2 μg/ml。检测限（Limit of detection，LOD）定义为信噪比（S/N）为3，检测限分别为0.5、0.01、0.01、0.01、0.1ng/ml。富集倍数的计算公式EF（Enrichment factor）=cs1/cs2，cs1和cs2分别为萃取后有机溶剂中化合物的浓度和萃取前样品相溶液中的浓度，富集倍数分别为 52、113、189、248、250 倍。

3.2 精密度

精密量取对照品，制成0.01、0.1、1 μg/ml三种浓度的溶液，按照上述最佳操作条件，平行六组实验，计算日间精密度，连续测定3日，计算日内精密度。测得日内精密度RSD为0.73%～1.53%，日间精密度RSD为0.95%～1.69%。

图5 盐浓度对富集倍数的影响

3.3 加样回收率

按照1.1.4制备加样回收率供试品溶液，取70 μl白芷溶液于10 ml容器中，加入浓度为0.5 μg/ml的7 ml对照品溶液，并如上述优化条件萃取，测定每种组分的平均回收率。测得花椒毒酚、补骨脂素、佛手柑内酯、花椒毒酚、欧前胡素和异欧前胡素的平均回收率和RSD分别为102.1%（1.27%）、101.8%（1.32%）、100.8%（0.89%）、100.5%（1.07%）、98.9%（0.92%）。

3.4 含量测定

取1.1.4项下制备的白芷供试品溶液，依上述方法操作，测定香豆素类成分含量，见图6。测得白芷粉末中花椒毒酚、补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素和异欧前胡素的平均含量分别为0.044 mg/g、0.385 mg/g、0.145 mg/g、1.12 mg/g、0.47 mg/g。

4 结论

本实验结果显示，佛手柑内酯、欧前胡素和异欧前胡素的富集倍数分别为189、248和250，明显高于花椒毒酚和补骨脂素的52倍和113倍，SFOD-LPME结合HPLC可以成功的用于白芷中这5种成分的前处理。

图6 白芷中香豆素类活性成分色谱图

漂浮有机液滴凝固液相微萃取具有操作简单、富集倍数高、成本低、检测限低等特点，可用于中药中微量天然化合物有效成分的分析。