红小豆与芸豆AREB1基因生物信息学分析

李海龙，段立华，方淑梅，李建英，孟文凯，梁喜龙*

(1 黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319；2 黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163316)

【研究意义】杂豆作为一类重要的粮食作物，在我国东北地区种植广泛，红小豆和芸豆是其中重要的两种，具有极高的食用及药用价值[1]。但是由于植物不具有自主逃避不利环境的能力，因此在其生长过程中经常遭受各种非生物逆境，如干旱、低温和盐碱胁迫等[2]，严重影响其生长发育过程及产量品质的提高。因此，开展有关杂豆抗逆机制的研究现已成为众多科研工作者的研究课题。【前人研究进展】脱落酸(abscisic acid，ABA)是植物体内一种重要的应激性激素，可参与多种生理调节过程，如种子休眠、气孔关闭及各种非生物胁迫的适应性应答[3-5]。ABA发挥生物功能主要通过改变ABA调节基因(ABA-regulated genes)的表达来实现[6-8]。有研究表明多数ABA调节基因都含有一个保守的顺式作用元件ABRE(ABA-responsive element，序列为PyACGTGGC)，其可参与ABA调节基因的表达[9,10]。AREB1(ABA responsive element binding protein 1)是ABA信号转导中最为重要的转录因子之一，其具有碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构，可以与ABRE元件结合，从而激活ABA调节基因的表达。ABA活化AREB1转录因子的信号传导途径可简略表达为PYR1→PP2C→SnRK2→AREB1[11-12]。在此过程中，ABA与PYRl结合，破坏了PP2C与蛋白激酶SnRK2之间的相互作用，使SnRK2的活性受到激发，从而活化AREBl转录因子[13-14]。活化的AREB1转录因子一方面与ABRE应答元件结合，从而引起下游依赖基因的表达[15]；另一方面AREB1转录因子与其它胁迫转录因子进行信息交流，共同调节胁迫相关基因表达，进而提高植物体对逆境的反应[16]。【本研究切入点】虽然迄今AREB1基因的研究已在较多作物中开展，但在杂豆类作物中仍鲜见报道。特别是它如何控制红小豆和芸豆抵抗非生物逆境胁迫还不清楚。【拟解决的关键问题】本研究以杂豆中的红小豆与芸豆为试验材料，应用生物信息学及分子生物学等手段对AREB1基因的性质及功能进行了初步分析，以期为进一步揭示该基因功能及其在杂豆抗逆中的作用，进而为最终建立杂豆高效稳定的抗逆体系奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 蛋白质序列的获取与确定

通过拟南芥据库网站(http://www.arabidopsis.org/)获取AREB1基因序列及相关信息[17]。再利用拟南芥数据库中所获取的AREB1基因的蛋白质序列(序列也可以用flast格式)与NCBI网站中的蛋白质数据库进行比对，生物类型分别选用芸豆、红小豆等，输入其拉丁文学名，从而进行下一步的相似度鉴定，这时会得出多组基因的各类信息，再根据所获信息确定同源蛋白数目。

1.2 进化关系分析

将所获取的AREB1蛋白质序列分别与其它植物、藻类和菌类等物种进行比对，从而获得相应的同源蛋白。再通过MEGA 5.0软件进行系统发育树的构建，同时对它进行校正。校正过程需要Neighbor-Joining在线软件[18]，最后完成系统发育树的构建与分析。

1.3 理化性质分析

利用在线预测软件(http://www.expasy.org/tools/)等对AREB1蛋白质序列的等电点、分子量、稳定性、亲水性、脂肪族氨基酸指数以及消光系数等理化特性进行预测与分析。

1.4 蛋白质结构研究

通过在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对其进行二级结构预测。

2 结果与分析

2.1 AREB1基因的确定与获取

首先利用拟南芥数据库，找出已经确定的AREB1基因所表达的蛋白质序列，再通过NCBI数据库进行比对，确定最终的蛋白质序列。本研究共获取以下8个相应蛋白质信息，红小豆为3个同源蛋白，芸豆为5个同源蛋白(表1)。8个蛋白质氨基酸数目均在401～415个，各蛋白质之间的E值、序列覆盖率、同源性均相差不大。

2.2 构建系统发育树

利用AREB1的氨基酸序列在NCBI和Phytozome中找到21个同源序列(表2)，通过MEGA 5.0软件构建包括红小豆与芸豆在内的多种生物AREB1氨基酸序列系统发育树(图1)。红小豆和芸豆的8种同源蛋白聚类在同一大分支内，分布于三处。其中，红小豆同源蛋白XP_017436679.1与绿豆XP_014501605.1聚在同一分支上，芸豆同源蛋白AGV54705.1与AAK39132.1聚在同一分支，这两分支聚在一起后又与大豆XP 003523938共在一个分支上，表明这几种蛋白之间亲缘关系较近；红小豆同源蛋白XP_017434239.1与KOM52069.1聚在同一分支，芸豆同源蛋白XP_007156509.1与XP_007156508.1聚在同一分支，这两分支又聚在同一大分支上，表明他们之间具有较近的亲缘关系。这些结果也证明这几种蛋白可能经历了相同或相似的进化途径。而芸豆中XP_007136688.1与其他7种蛋白均不在同一分支上，亲缘关系较远，而与金鱼藻的亲缘关系较近。推测XP_007136688.1蛋白可能是在适应外界环境条件时经历了不同的适应性进化[19]。

表1 红小豆和芸豆AREB1基因的相应信息

表2 系统发育树构建所需物种的信息

图1 AREB1系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of AREB1

2.3 理化性质分析

通过在线预测软件(http://www.expasy.org/tools/)对蛋白质各类理化性质进行预测(表3)。8种蛋白质序列均为不稳定的亲水性蛋白。其中，芸豆蛋白XP_007136688.1各种性质明显不同于其它几种。分子量最小，等电点最低，仅为6.12，且其消光系数明显高于其它几种，表明该蛋白可能在空间结果及功能上存在特异性。除XP_007136688.1以外，其他7种蛋白质均为碱性蛋白，分子量、等电点、消光系数、脂肪族氨基酸指数等理化性质差异均较小。

表3 红小豆与芸豆AREB1蛋白质的理化性质

表4 AREB1蛋白二级结构所占百分比

2.4 红小豆与芸豆AREB1蛋白的二级结构分析

蛋白质的结构对其功能和活性均有重要影响，因此蛋白质空间结构的研究对其功能的探讨有着重要的指导性作用。使用在线软件对8种蛋白质二级结构进行分析(表4)，结果表明：8种蛋白质均以α-螺旋和无规则卷曲为主要二级结构、而β-折叠结构仅约为α-螺旋的三分之一，其含有大量的无规则卷曲结构可能与它连接较多的二级结构元件有关。

3 讨 论

植物体内的AREB1基因对于调控基因表达，抵抗非生物逆境胁迫具有非常重要的意义[20]。前人通过对拟南芥体内AREB/ABF类转录因子亚家族的研究找寻到突破口，在其他作物上展开研究。就目前而言，花生[21]、小麦[22]、大麦[23]、番茄[24]、大豆[25]、水稻[26]等多种植物中的AREB1基因均得到了鉴定与研究。然而对于杂豆类AREB1基因的研究却所知甚少。本研究利用构建系统发育树和同源比对分析的方法初步确定了红小豆AREB1三个同源蛋白分别是XP_017436679.1、XP_017434239.1、KOM52069.1以及芸豆AREB1的五个同源蛋白各为AGV54705.1、XP_007136688.1、AAK39132.1、XP_007156509.1、XP_007156508.1，对于芸豆AREB1基因蛋白序列的研究方面发现，其5种同源蛋白当中XP_007136688.1的理化性质与其他7种蛋白序列上均存在较大差异，且其同源性较低，这也说明XP_007136688.1在功能或者其他方面与其他7种蛋白序列具有不同特性。

前人研究表明，在拟南芥中AREB/ABF类转录因子亚家族含有ABF1、ABF2/AREB1、ABF3、ABF4/AREB2四类转录因子[11]。ABF1主要参与低温胁迫应答反应，ABF2/AREB1、ABF4/AREB2主要在干旱、ABA、氧化、高盐及热胁迫下发挥作用，ABF3主要受氧化、高盐、ABA、低温及热胁迫诱导。通过前人在AREB1基因表达领域的研究发现，过表达AhAREB1拟南芥幼苗的根尖和成苗的叶片边缘生长素含量显著提高，生长素运输蛋白基因LAX3和生长素响应基因IAA29的表达均显著下降，而生长素响应蛋白基因ARF9和ARF2显著上调，有效的提高了拟南芥生长素含量，增强其抗旱能力[27,28]；在干旱、盐碱、茉莉酸甲酯、SA和ABA等胁迫下，毛果杨中AREB1基因的启动子序列可以驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达，这也说明毛果杨AREB1基因可能与盐碱、干旱等胁迫应答紧密相关[29,30]；对于烟草AREB1基因的表达量而言，根系的表达量最大，茎、叶、花次之，同时烟草AREB1基因表达更易受到各种非生物胁迫因素的影响，PEG、干旱、盐碱、低温、ABA诱导烟草AREB1上调表达，而茉莉酸甲酯诱导烟草AREB1下调表达[31,32]；在花生方面，不同品种花生在干旱条件下AREB1表达量都有所增加，同时抗旱品种的表达量显著高于一般品种，表明花生AREB1基因在干旱胁迫下发挥重要作用[20,32]。虽然AREB1基因在多种作物上均已深入研究，若要确切的确定AREB1基因在红小豆与芸豆上参与的非生物逆境胁迫应答反应类型，还需通过正反遗传学试验进行更深层次的验证。

4 结 论

本研究表明：AREB1基因蛋白序列在红小豆及芸豆上的8个同源蛋白均为不稳定的亲水性蛋白，除芸豆蛋白XP_007136688.1外其他7种均为碱性蛋白，在分子量、等电点、消光系数、脂肪族氨基酸指数等理化性质方面差异较小，同时8种同源蛋白的二级结构均由α-螺旋、β折叠、β-转角以及无规则卷曲四种结构所构成，各类型在8种同源蛋白中所占比例均相近，这种相似的二级结构可能决定了他们在蛋白质功能与调控途径方面的相似性。在系统发育树构建的过程中我们发现菜豆属四种植物的蛋白序列均在一个大分支上，同源性较高，而杂豆类作物大多属于菜豆属，这也证明AREB1基因于菜豆属上均存在。