不同柳树花粉离体培养及活力测定方法比较研究

王伟伟，姚 玲，何开跃，王保松, 何旭东 *

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 210014； 2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台， 江苏 南京 210014； 3. 南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

柳树，是指杨柳科 (Salicaceae) 柳属(Salix)所包含的所有树种。全世界共有500余种柳树，主要分布于北半球寒温带潮湿的生境中，通常表现为乔木和灌木2种形态。灌木柳因其萌蘖快、更新容易、生物量高，在北美及欧洲已作为一种重要的可再生、可持续的生物质能源作物被大面积种植[1]；而乔木柳由于生长快，适应性强，树形优美，在中国主要用于园林景观及木材工业原料[2]。尽管杨树与柳树同属杨柳科，是进行木本植物遗传学与基因组学研究的模式树种，但其多样性的丰富程度远不及柳树。从表型水平上看，柳树的花型、叶型、树型、花色、花芽、枝条颜色等变异异常丰富[3]；从染色体水平上看，虽然杨树与柳树染色体基数均为19条，但杨树大多为2倍体，而柳树从2倍体到10倍体均有存在[4]。尤为重要的是，一些灌木柳扦插后1 a即可开花，容易建立高世代的遗传谱系，可作为林木遗传学研究的理想模式树种[5]。

花粉作为植物种质的一种形式，包含了父本全部的基因信息，是植物生殖、遗传、进化及育种的重要研究对象。而花粉活力又是花粉存活、生长、萌发及发育的前提，是植物育种成败的关键[6]。柳树分布广泛、种类繁多，自然条件下花期主要集中于3月至6月，其种间、杂种间、亲本与杂种间花粉活力差异较大[7]。柳树花粉活力的保持是解决花期不遇以及远距离杂交困难的关键，而花粉活力的测定，则是开展遗传改良与品种选育工作的首要前提。虽然柳树的生物学地位尤为重要，但柳树花粉相关研究却很少[7-8]。本研究选取6个柳树不同亲本及杂交个体开展花粉离体培养，比较不同花粉活力测定方法，旨在揭示柳树不同个体间花粉变异特点，为柳树杂交育种工作提供技术支持，也为下一步柳树花粉保存与活力维持提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为4个亲本个体与2个杂交子代个体，包括灌木和乔木2种类型(见表1)。其中银柳、簸箕柳、蒿柳×毛枝柳和簸箕柳×蒿柳采自江苏省林业科学研究院柳树种质资源圃，垂柳和紫柳采自南京市玄武湖公园。3月初将带有柳树花芽的花枝采回实验室水培，室温保持20—25 ℃。待雄花盛开后，用毛笔轻蘸收集花粉于5 mL的离心管中备用。

表1 供试材料信息

1.2 花粉离体培养

1.2.1 最佳培养基筛选 通过前期预实验确定培养基中琼脂质量浓度为7g/L。试验选取 L25(56) 正交表，对蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)23个影响因子进行优化(见表2)。在双孔凹型玻片孔内滴入培养基0.1 mL，用小毛笔将采取的新鲜花粉均匀散布在培养基上，25 ℃光照培养12 h，统计花粉萌发率，重复4次。

表2 柳树花粉离体培养基正交试验设计

1.2.2 光暗条件和最佳观测时间筛选 根据试验确定的最佳培养基，分别在25 ℃光照培养箱和暗培养箱中培养，于0.5，1，2，4，6，8，10，12，14，16 h 进行萌发率统计，重复4 次，以确定花粉萌发是否需要光照及最适观察统计时间。

1.2.3 最佳培养温度的筛选 将花粉分别于4，15，25，35 ℃培养于最佳培养基上，在试验确定的最佳观测时间进行观察，统计萌发率，重复4 次。

1.3 花粉活力测定

本试验选取离体培养法、蓝墨水染色法、I2-KI 染色法和TTC染色法4种常用的植物花粉活力检测方法进行比较，以确定不同柳树个体的最适宜的花粉测定方法。

1.3.1 离体培养法 在最佳培养条件下培养，显微镜下检测花粉萌发。滴培养基1滴于载玻片中央，用毛笔轻蘸少量花粉置于培养基上，并将载玻片放进铺有浸湿滤纸的培养皿中。若花粉管的长度超出花粉的直径则视为花粉萌发。萌发率计算公式为萌发率=萌发的花粉数/检测的花粉总数×100%

1.3.2 蓝墨水染色法 用毛笔轻蘸少量花粉置于载玻片上，用普通蓝墨水(0.05 g/mL)染色15 min。因活细胞膜具有选择吸收的能力，当加入蓝墨水时，没有活力的花粉会被染色，没有被染色的花粉则有活力。

1.3.3 I2-KI 染色法 用毛笔轻蘸少量花粉置于载玻片上，轻轻滴入1% I2-KI溶液1滴，盖上盖玻片并置于显微镜下观察。有活力的花粉被染成蓝黑色，没有活力的花粉为无色。

1.3.4 TTC染色法 用毛笔轻蘸少量花粉置于载玻片上，轻轻滴入1%TTC 溶液1滴，盖上盖玻片后将载玻片放入恒温箱中培养，温度设置为25 ℃。15 min 后置于显微镜下观察，红色花粉为有活力，无色的花粉则没有活力。

1.4 数据分析

图表处理、方差与极差分析、Duncan 多重对比与相关性分析利用SPSS 17.0与Excel 2007软件进行。

2 结果与分析

2.1 离体培养条件优化

2.1.1 最佳培养基筛选 不同柳树花粉离体培养正交试验结果统计见表3。因培养基中蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2质量浓度与组合不同，6个柳树亲本及杂交种个体之间花粉萌发率存在显著差异(P<0.05)。同时极差分析表明各柳树不同花粉培养基的最佳配比也存在差异(见表4)。各因素对P102，P63和2383的花粉萌发率作用大小为A>C>B，对2333，垂柳和紫柳的作用大小为A>B>C。P102理论最佳培养基组合为A3B2C1，P63理论最佳培养基组合为A2B2C2，2333和2383理论最佳培养基组合为A1B2C1，垂柳和紫柳理论最佳培养基组合为A2B4C1。采用本试验确定的最佳理论组合对柳树花粉进行离体培养，P102，P63，2333，2383，垂柳和紫柳的萌发率分别为80.2%，81.1%，75.6%，66.8%，82.8%和84.7%，均高于或接近正交试验的最高萌发率，表明各最佳组合稳定合理。

表3 柳树花粉离体培养正交试验统计

表4 柳树花粉正交试验极差分析

2.1.2 光暗条件和最佳观测时间筛选 以选择出的最佳培养基为基础，6个不同柳树亲本及杂交种个体在光照和黑暗2个条件下花粉离体培养的萌发率随着培养时间变化情况如图1所示。在光照和黑暗2种条件下，培养前期各柳树的花粉离体萌发率均出现快速上升；随着培养时间的持续增加，花粉离体萌发率逐渐趋于平稳。光照和黑暗对花粉的离体萌发率影响不大，在相同的培养时间下差异不显著(P> 0.05)。6个不同柳树亲本及杂交种个体花粉离体萌发培养时间以10—12 h为宜，其中P102，P63，2333和2383花粉离体培养最佳时间为12 h，而垂柳和紫柳则为10 h。

2.1.3 最佳培养温度筛选 6个不同柳树亲本及杂交种个体分别用最佳培养基进行花粉离体培养。结果表明：随着培养温度的不断升高，不同柳树个体花粉离体萌发率均呈现出先高后低的变化趋势，且与其他各个温度间有显著差异(P< 0.05)，花粉离体萌发的最佳温度均为25 ℃(见表5)。

表5 温度对不同柳树花粉离体培养萌发率的影响

同列数据(平均值±标准误)后不同小写字母表示在P<0.05水平上存在显著性差异

图1 光照及培养时间对柳树花粉离体培养的影响

2.2 花粉生活力测定方法比较

通过预试验，确定蓝墨水染色法、I2-KI 染色法和TTC 染色法均可用于柳树花粉生活力的测定。将离体培养法与3种染色法进行比较，结果见图2。4种测定方法在P102，P63和垂柳上均差异显著(P<0.05)，花粉活力顺序为蓝墨水染色法>离体培养法> I2-KI 染色法>TTC 染色法。蓝墨水染色法和离体培养法在杂交子代2333上不存在显著差异(P>0.05)，但显著(P<0.05)高于I2-KI 染色法和TTC 染色法，花粉活力顺序为蓝墨水染色法=离体培养法>TTC 染色法> I2-KI 染色法，且TTC染色法仅能将2333染色。在2383和紫柳中蓝墨水染色法和离体培养法之间不存在显著差异(P>0.05)，但显著(P<0.05)高于I2-KI 染色法和TTC 染色法，花粉活力顺序为蓝墨水染色法=离体培养法> I2-KI 染色法>TTC 染色法。

每个供试材料图中，不同小写字母表示花粉活力测定值之间存在显著性差异(P<0.05)图2 柳树花粉离体培养法与染色法之间的花粉活力比较

3 结论与讨论

3.1 培养条件对花粉离体培养的影响

在一定的培养条件和温度控制下，花粉活力可根据其离体培养时的萌发率来判定，这种方法的优点在于简单、迅速、合理，并可完全定量[9]。但花粉萌发条件对离体萌发法测定花粉活力时影响较大，如营养物质、培养温度与时间、矿质元素等[10-11]。

蔗糖不仅是花粉萌发的主要营养物质，还可以调节萌发环境中的渗透压，适宜的蔗糖质量浓度对花粉离体萌发有一定的促进作用[12]，但当蔗糖质量浓度过高时，培养基中渗透压增大，会导致花粉失水，产生质壁分离和花粉管破裂等现象，从而抑制花粉离体萌发[13-15]。最适蔗糖质量浓度因树种不同而存在差异[16-18]。硼酸参与果胶质的合成和糖分的吸收、转运和代谢等，从而促进花粉的离体萌发[19-21]。在花粉管的极性、顶端和定向生长中，可通过添加外源Ca2+的量来促进花粉管的伸长，但外界Ca2+质量浓度过高可导致牵引型的Ca2+通道受损，从而抑制花粉管的生长[22]。而本研究的结果表明，不同柳树亲本及杂交种个体对培养基中蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2的需求差异较大。

温度对花粉离体培养影响不同，温度过高或过低都不利于花粉的萌发。不同植物的花粉萌发和花粉管生长的最适温度存在差异。如伊朗杏树花粉离体萌发最佳培养平均温度为24.2 ℃[23]；黄连木花粉离体培养的平均最适温度为23.9 ℃[24]，枣树花粉萌发的适宜温度为 25 ℃[25]，而本研究中不同柳树个体花粉萌发的最适温度均为25 ℃。

光照对花粉培养也有不同的影响。如马尾松花粉黑光下易于萌发[26]，但东方百合光照条件下的花粉萌发率高于黑暗条件[27]，而光照和黑暗对桂花花粉萌发无显著影响[28]，甚至有研究表明光照对枣树花粉萌发表现出的抑制作用强弱与品种有关[25]。本研究中，柳树花粉光照培养萌发率略高于暗培养，但差异不显著。

花粉的萌发过程需要在一定的时间内完成，不同植物的花粉达到萌发最大值所需的时间不同。如石榴“泰山红”花粉最佳培养时间为3 h[29]，悬铃木花粉培养24 h后萌发率最高[30]。本研究中，柳树花粉0.5 h后开始萌发， 10—12 h后萌发率趋于稳定，继续培养则花粉管过长，不利于观察。因此，柳树花粉适宜培养时间为10—12 h，其中灌木柳为12 h，乔木柳为10 h。

3.2 花粉活力测定方法比较

离体萌发测定法数据准确，可直接区分有活力和无活力的花粉，但需要根据不同的树种配制培养基，优化不同的培养时间和温度等条件，时间消耗相对过长。染色法测定相对简单，可用于花粉活力的快速测定，但由于受花粉自身的特性影响，结果会出现一定程度的偏差[10]。因此，不同植物所适合的染色法也不尽相同。如金娃娃萱草适宜的染色剂为TTC[14]；而槐树花粉仅适用于培养基萌发法，I2-KI染色法与TTC染色法均无法进行测定[31]。本研究中，TTC法仅能将杂交子代个体2333染色且测定的花粉活力较低，这可能与其他种的个体花粉外壁太厚，TTC溶液未能进入花粉细胞内有关。I2-KI染色法虽可将花粉染色，测定的花粉活力显著低于离体培养法。蓝墨水染色法在2383，2333和紫柳3种柳树花粉活力的测定中与离体培养法间差异不显著，故可代替离体培养法对2383，2333和紫柳等3种柳树花粉的生活力进行快速测定。