siRNA靶向沉默TrkB基因对人膀胱癌细胞株T24生长和转移的影响及其分子机制

2018-09-13 09:55邢增术刘振湘白志明
中国老年学杂志 2018年17期
关键词:信号转导细胞株膀胱癌

邢增术 张 冲 刘振湘 白志明

(中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科,海南 海口 570208)

近年来研究发现〔1~3〕,酪氨酸激酶受体(Trk)B在某些恶性肿瘤组织中过度表达,导致肿瘤细胞的增殖能力和侵袭转移能力明显提高,但其在膀胱癌增殖转移分子机制中的具体作用国内外未见报道。本研究探讨siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24生长和转移的影响及其分子机制。

1 材料和方法

1.1材料 (1)细胞株:人膀胱癌T24细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。(2)主要耗材及试剂:超低黏附培养板购自美国Corning 公司;人重组脑源性神经营养因子(rhBDNF)购自美国R&D公司;Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司;委托广州锐博生物科技有限公司设计和合成siRNAOligo;一抗和二抗均购自美国Santa Cruz 公司。

1.2细胞培养 将膀胱癌T24细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞近90%融合时用胰蛋白酶消化传代。

1.3T24细胞的siRNA转染 TrkB(NTRK2)-siRNA1:上游5′-CCGUCACCUUGACUUGUCUTT-3′,下游5′-AGACAAGUCAAGGUGACGGTT-3′;TrkB(NTRK2)-siRNA2:上游5′-CCACGAACAGAAGUAAUGATT-3′,下游5′-UCAUUACUUCUGUUCGUGGTT-3′;TrkB(NTRK-2)-siRNA3:上游5′-GCGCUUCAGUGGUUCUAUATT-3′,下游5′-UAUAGAACCACUGAAGCGCTT-3′;阴性对照组:上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按Lipofectami-n2000进行转染,转染后48 h检测目的基因蛋白,选择敲低效率最高者留作进一步实验。

1.4吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)双染色法观察细胞失巢凋亡情况 将转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)分别置于6孔超低黏附性培养板中与浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共悬浮培养72 h,分别收集两组细胞制成细胞悬液。按试剂盒说明操作后荧光显微镜下观察。

1.5MTT法检测细胞生长 于细胞对数生长期,收集转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA),分别制成细胞悬液后接种于96孔板,每孔加入浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培养。于培养第0、12、24、48、72、96 h时各时间点分别收获细胞,按MTT法在酶标仪上检测各孔的OD值,绘制生长曲线。

1.6软琼脂克隆形成试验检测细胞克隆形成能力 分别取对数期转染siRNA-TrkB的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA),与浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培养在制备好的软琼脂6孔板中10 d,计数含50个细胞以上的克隆数,计算细胞集落形成率。

1.7Transwell小室法检测细胞侵袭能力 收集转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA),加入无血清培养基制成细胞悬液,接种于铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室,并加入rhBDNF;下室加入含20% FBS的RPMI1640培养基,培养24 h,棉签擦去上室未穿膜细胞,甲醇固定再予结晶紫染色,镜下随机5个视野(×100)拍照并计数穿过膜的细胞数。

1.8Western印迹检测蛋白表达 用RIPA裂解液裂解细胞蛋白,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,经十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,低温恒压电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗4℃孵育过夜,加入山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,室温下孵育1 h,电化学发光法(ECL)化学发光,与内参β-actin比较,Image J软件进行定量分析。

1.9统计学处理 用SPSS19.0软件进行t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1靶向沉默TrkB基因siRNA序列的筛选 TrkB-siRNA转染T24细胞以敲低TrkB的表达,并通过Western印迹检测敲低效率,选择敲低效率最高的TrkB-siRNA3(图1)进行下一步实验。

图1 膀胱癌细胞株T24转染NT-siRNA或siRNA-TrkB 48 h后Western印迹

2.2siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24抗失巢凋亡能力的影响 沉默TrkB基因的T24细胞经悬浮培养后大量凋亡,多个视野可见晚期凋亡细胞,核染色质发橙红色荧光,呈固缩或串珠状,有时核碎裂散布于胞质中,只有极少量正常活细胞可见。而阴性处理组T24细胞经悬浮培养后亦有细胞凋亡情况,但多个视野下可见许多正常活细胞,核染色质着绿色并呈正常结构(图2)。表明siRNA靶向沉默TrkB基因后膀胱癌T24细胞的抗失巢凋亡能力明显下降。

图2 NT-SiRNA T24悬浮培养72 h AO/EB双染色荧光显微镜观察(×400)

2.3siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力的影响 与阴性处理组相比,靶向沉默TrkB基因后T24细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05),见图3~6,表1。

与NT-siRNA组比较:1)P<0.05;同表1,表2图3 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响

组别细胞增殖率(×100%,n=10)克隆形成率(%,n=6)迁移力(划痕愈合比,n=6)侵袭力(细胞个数/HP,n=6)NT-siRNA组5.54±0.3546.70±4.550.36±0.02101.00±11.20TrkB-siRNA组3.21±0.311)24.50±3.041)0.22±0.031)32.38±3.291)

图4 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞克隆形成能力的影响(×200)

图5 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞迁移能力的影响(×200)

图6 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响(×200)

2.4siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号转导通路活性及上皮间质转化(EMT)相关蛋白的影响 与NT-siRNA组相比,靶向沉默TrkB基因后,T24细胞E-钙黏蛋白(cadherin)的表达水平明显提高,而N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)表达水平明显下降,p-Akt及EMT 相关核蛋白扭曲蛋白(Twist)、Snail、Slug表达水平显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2,图7。

表2 siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24 PI3K-Akt信号转导通路活性及EMT相关蛋白的影响

图7 沉默TrkB对T24细胞PI3K-Akt信号转导通路及EMT相关蛋白的影响

3 讨 论

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一,因其具有起源多中心性,易复发、转移等生物学特性,经治疗后仍有30%的患者后期发生肿瘤侵袭和转移,成为威胁患者生命的最重要因素〔4〕。

TrkB与其配体BDNF结合可激活多个重要信号传导通路,包括PI3K-Akt途径、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径和磷脂酶C途径,这些信号通路与细胞凋亡、增殖和浸润转移关系密切〔5,6〕。特别是近来研究发现TrkB在多种肿瘤中高表达,提示TrkB可能作为一种原癌基因在肿瘤的发生和转移过程中发挥重要作用〔1~3〕。本研究结果提示TrkB基因可明显影响膀胱癌T24细胞的增殖及转移侵袭能力。为进一步了解TrkB影响膀胱癌T24细胞转移侵袭能力的可能分子机制,本研究发现靶向沉默膀胱癌T24细胞的TrkB基因后,不仅其PI3K-Akt信号转导通路的活性下降,而且EMT受抑制,使得细胞的增殖及转移侵袭能力明显下降。据研究〔7,8〕,BDNF特异性与TrkB的胞外区结合后可诱导胞内酪氨酸残基磷酸化,启动BDNF-TrkB信号转导通路,其下游的PI3K-Akt信号转导通路随之被激活,被磷酸化激活的Akt在下调促凋亡蛋白Bad、Bim表达的同时,上调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达,导致失巢凋亡抵抗的发生,赋予肿瘤细胞迁移到其他部位再次生长的能力。因此TrkB可激活PI3K-Akt信号通路使肿瘤细胞获得失巢凋亡抵抗特性,从而发生转移。EMT是大多数上皮性肿瘤发生侵袭转移的一个极其重要的初始步骤〔9〕。研究表明〔10〕,TrkB可经PI3K/Akt信号转导通路激活下游EMT相关核蛋白,如Twist、Snail、Slug和ZEB1,后者与核内E-cadherin 转录启动子结合,从而下调其转录表达,导致肿瘤细胞间黏附能力下降;而间充质标志物如N-cadherin、Vimentin表达上调,促使cadherin转换现象的发生,使得肿瘤细胞的迁移能力明显提高。这可能是上皮肿瘤发生侵袭和转移的细胞分子生物学基础。

综上,siRNA靶向沉默TrkB基因可通过下调膀胱癌T24细胞PI3K-Akt信号转导通路的活性进而抑制EMT,从而降低其增殖及转移侵袭能力。本研究为膀胱癌的治疗策略提供了新的依据。

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