榨菜中柠檬黄、日落黄测定的探讨和改进

刘超，景赞，邹沫君，冯慧，黄志勇，吕雪梅

(乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000)

榨菜是人们日常喜爱的酱腌菜，但近几年一些不法商贩为了使其颜色更鲜艳在其中超限量添加柠檬黄、日落黄等人工合成着色剂[1]。人工合成着色剂，常以苯、甲苯等为原料，先制备色素中间体，再将1种或者2种中间体进行磺化、偶合、缩合和偶氮化等化学反应而制成，人工合成着色剂不能提供人体所需的任何营养物质，且一些人工合成着色剂还会危害人体健康，如致泄性、致突性与致癌作用等[2]。柠檬黄、日落黄即是2种典型的人工着色剂。GB 5009.35-2016《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》[3]，采用聚酰胺吸附食品中的人工着色剂，并用乙醇胺溶液进行洗脱。聚酰胺对合成着色剂的吸附能力会受到温度的影响，回收率较低。同时操作步骤复杂，不适合大批量样品的处理。柠檬黄和日落黄均具有苯磺酸钠结构，本试验采用混合型弱阴离子交换柱，用于吸附柠檬黄和日落黄，采用氨化甲醇洗脱，简化了步骤的同时，极大地提高了回收率，在国内尚属首次。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

乙腈：色谱纯，Fisher Chemical 提供，批号：75-05-8；甲醇：色谱纯，Dikma提供，批号：67-56-1；乙酸：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司提供，批号：20140421；乙酸铵：优级纯，天津市光复科技发展有限公司提供，批号：50166；无水乙醇：分析纯，成都市科隆化学品有限公司提供，批号：2017041901；氨水：分析纯，成都市科龙化工试剂厂提供，批号：2015051202。

1.2 标准物质

柠檬黄：德国Dr. Ehrensorfer GmbH提供，Lot：96938，纯度：95.5%；日落黄：北京坛墨质检科技有限公司提供，批号：T160092 纯度：99.3%。

1.3 色谱条件

色谱柱：EC 250/4.6 NUCLEODUR C18Grauty 5 μm，流动相：A：甲醇；B：20 mmol/L乙酸铵；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；波长：254 nm。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱Table 1 Gradient elution

1.4 标准曲线的配制

1.4.1 标准储备溶液的制备(1.0 mg/mL)

分别精密称取10 mg柠檬黄、日落黄至2个10 mL容量瓶中，用pH 6的水溶液定容至刻度。

1.4.2 混合标准中间溶液(0.1 mg/mL)

分别吸取1 mL的柠檬黄、日落黄标准储备溶液至10 mL容量瓶中，用pH 6的水溶液定容至刻度。

1.4.3 混合工作溶液的制备

分别吸取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的柠檬黄、日落黄混合标准中间溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。柠檬黄、日落黄浓度分别为1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL。

1.5 样品制备

提取：精密称取样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入1%氨水溶液10 mL，涡旋提取60 s后，超声提取30 min(功率：500 W)，期间每隔5 min漩涡震荡30 s，冷却至室温后，4500 r/min离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水溶液(20%)调节pH至6左右，待净化。

净化：取已活化好的Cleanert PWAX(150 mg/6 mL)固相萃取柱(依次用6 mL甲醇、6 mL pH 6～7的水活化)，加入提取液10 mL，开动真空泵，使溶液按照5 mL/min的速度流下。溶液完全流干后，依次用6 mL水(pH 4)、甲醇-乙酸(6∶4)、6 mL水(pH 6～7)淋洗。开动真空泵，使淋洗液完全抽干后，用6 mL 2%氨化甲醇洗脱，接收洗脱液，收集液于50 ℃氮吹仪吹干，1 mL水定容。0.45 μm的水相滤膜过滤，待测。

1.6 方法的检出限与定量限

精密称取空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入1%氨水溶液10 mL，涡旋提取60 s后，超声提取30 min(功率：500 W)，期间每隔5 min漩涡震荡30 s，冷却至室温后，4500 r/min离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水溶液(20%)调节pH至6左右，待净化。取已经活化好的Cleanert PWAX(150 mg/6 mL)固相萃取柱(依次用6 mL甲醇、6 mL pH 6～7的水活化)，加入提取液10 mL，开动真空泵，使溶液按照5 mL/min的速度流下。溶液完全流干后，依次用6 mL水(pH 4)、甲醇-乙酸(6∶4)、6 mL水(pH 6～7)淋洗。开动真空泵，使淋洗液完全抽干后，用6 mL 2%氨化甲醇洗脱，接收洗脱液，收集液于50 ℃氮气吹干，1 mL水定容。过0.45 μm的水相滤膜过滤，作为空白溶液。用空白样品溶液将混合标准工作液稀释至产生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根据色谱图测得信噪比，按S/N=3∶1、S/N=10∶1计算检出限和定量限。

1.7 方法的准确性

低浓度加标回收溶液：精密称取空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入一定量混合标准中间溶液，然后按样品制备方法操作，配制成2.0 μg/mL的质控样品。

中浓度加标回收溶液：精密称取空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入一定量混合标准中间溶液，然后按样品制备方法操作，配制成4.0 μg/mL的质控样品。

高浓度加标回收溶液：精密称取空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入一定量混合标准中间溶液，然后按样品制备方法操作，配制成8.0 μg/mL的质控样品。

1.8 方法的精密度

精密称取3个空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入一定量混合工作溶液，每个空白样品中加入混合标准中间溶液0.04 mL，然后按样品制备方法操作，供试品溶液连续进样6针，计算峰面积RSD值。

1.9 方法的重复性

取浓度为4.0 μg/mL的质控(QC)样品各6份经前处理后进样分析，测得2种色素的峰面积，代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，获得重复性结果。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

图1 日落黄标准曲线Fig.1 Standard curve of sunset yellow

图2 柠檬黄标准曲线Fig.2 Standard curve of lemon yellow

精密称取空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，准确加入10，20，40，60，80，100 μL混合对照品工作液，按上述方法进行前处理，即得柠檬黄、日落黄浓度范围为1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL的基质标准曲线。将10 mL混标注入高效液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并列出标准曲线方程和线性范围。

由图1和图2可知，柠檬黄、日落黄在1.0～10.0 μg/mL的浓度范围内r值依次为0.9995，0.9997，均≥0.99，所以柠檬黄、日落黄线性范围良好。选取1.0～10.0 μg/mL为本试验的线性范围。

2.2 专属性、检出限和定量限

目标化合物出峰处无干扰，色谱图应清晰可见，柠檬黄、日落黄色谱图见图3。

图3 柠檬黄、日落黄色谱图Fig.3 Chromatogram of lemon yellow and sunset yellow

采用空白样品加标准溶液的方法测定[4-8]，精密称取空白样品约2.0 g于50 mL塑料离心管中，按上述方法进行前处理，得空白样品溶液，用空白样品溶液将混合标准工作液稀释至产生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。柠檬黄的方法检出限为0.15 mg/kg，定量限为0.50 mg/kg；日落黄的方法检出限为0.12 mg/kg，定量限为0.40 mg/kg。

2.3 方法的准确性

表2 不同浓度下的柠檬黄回收率结果(n=3)Table 2 Recoveries of lemon yellow at different concentration levels(n=3)

表3 不同浓度下的日落黄回收率结果(n=3)Table 3 Recoveries of sunset yellow at different concentration levels(n=3)

采用空白样品加标准溶液回收法测定，取浓度分别为2，4，8 μg/mL的质控(QC)样品3份经前处理进样分析，每种浓度平行进样3针，测得2种合成着色剂的峰面积，代入随行的基质标准曲线，计算浓度，除以理论加入浓度，获得方法的回收率，即准确度结果。

由表2和表3可知，柠檬黄、日落黄在低、中、高3个水平回收率均在80%～110%之间。低浓度回收率略低，随着浓度的增大，回收率接近100%，这是因为在低水平时，系统误差较大，随着浓度的增加，系统误差逐渐变小。

2.4 方法的重复性

表4 重复性测定结果(柠檬黄) Table 4 Repeatability (RSD) of lemon yellow

表5 重复性测定结果(日落黄) Table 5 Repeatability (RSD) of sunset yellow

取浓度为4.0 μg/mL的质控(QC)样品各6份经前处理后进样分析，测得2种色素的峰面积，代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，获得重复性结果。由表4和表5可知，柠檬黄、日落黄的重复性(RSD值)均<5%，表明方法的重复性良好。

2.5 方法的精密度

表6 精密度测定结果(柠檬黄)Table 6 Precision (RSD) of lemon yellow

表7 精密度测定结果(日落黄)Table 7 Precision (RSD) of sunset yellow

精密称取3个空白样品2.0 g于50 mL塑料离心管中，加入一定量混合工作溶液，每个空白样品中加入混合标准中间溶液0.04 mL，然后按样品制备方法操作，供试品溶液连续进样6针，计算峰面积和RSD值。由表6和表7可知，柠檬黄、日落黄的精密度均<3%，表明仪器精密度良好。

3 结论

本试验针对榨菜中柠檬黄、日落黄建立了高效液相色谱检测方法。着重考察了该方法的检出限、定量限、专属性、线性范围、方法的准确性、重复性、精密度等指标。结果显示：该方法在1.0～10.0 μg/mL范围内具有良好的线性；方法检出限为柠檬黄：0.15 mg/kg、日落黄：0.12 mg/kg；添加浓度在2.0，4.0，8.0 μg/mL 3个水平条件下的平均回收率在80%～100%之间；2种合成色素的重复性<5%、精密度<3%。该方法具有操作简单、干扰少、灵敏度高、稳定性好、结果准确等特点，适用于榨菜中柠檬黄、日落黄的测定。