模拟酸雨对桑树叶片生长及其光系统Ⅱ活性的影响

王 月，许博涛，滕志远，张书博，张秀丽，孙广玉

(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

酸雨指pH<5.6的大气降水(雨、雪、露、雾)，其内含有Na+、K+、Mg+、Ca2+、NH4+、SO42-、F-、Cl-、NO3-和一些有机物质等成分[1]。随着我国的工业化进程加快，燃煤发电排放的SO2和烟尘，经过复杂的大气物理化学反应形成的酸雨已成为不可忽视的重大环境问题[2]。据报道我国的酸雨在时空分布方面具有明显差异，而近年来，我国受酸雨危害的范围由原来的长江以南地区逐渐向北方扩展，东北地区已成为受酸雨污染严重的区域[3]。尤其是植物生长旺季(6-8月)酸雨沉降频率增多,程度增大[4]，而研究表明酸雨对植物生长的影响具两面性：其一，强酸雨降落在植物器官上使其光合和呼吸等代谢紊乱[5]，更为严重时表现为细胞坏死[6]、叶片褪绿[7]、植株失水枯萎[8]等现象，严重影响植物生长；其二，轻度酸雨对某些植物生长无明显影响[8],甚至可以促进某些植物叶片的光合作用[9]，模拟酸雨中主要离子成分是NO3-和SO42-，对N、S代谢能力强的植物可以将其作为营养直接代谢。胡月等[9]发现，pH≥4.5的模拟酸雨对东北地区秋雨桑(Morusalba)的光合性能具有良好的促进作用，而pH≤3.5的模拟酸雨则抑制桑树叶片的光合性能。随着人们对桑树价值认可程度的提高，桑树的栽培区域由原来东南沿海地区逐渐向东北和内陆地区扩张，加之我国“东桑西移，南蚕北移”工程的实施，各地区政府扶植力度逐年增加。

桑树对环境的适应能力较强，且用途广泛，既可入药，开发保健、功能性食品，又可以用于防风固沙以及作为开发畜牧业的新型高蛋白饲料源。为此，近年来在黑龙江省的栽培面积逐年增多，有关黑龙江省桑树在施肥量[10]、肥料种类[11]、种植方式[12]等栽培管理措施的研究日益增多，围绕桑树对东北地区特有的环境因子诸如低温[13]、干旱[14]和盐碱[15]等逆境响应特征的研究日益深入，主要集中在桑树叶片的光合性能，相比于具有表征特性的光合气体交换参数，具有内禀性的叶绿素荧光参数则能更深入地分析叶片光系统Ⅱ(PSⅡ)对光能的吸收、传递、激发和分配等情况[16]，并且可以快速准确地分析出逆境对植物光合作用中PSⅡ的伤害位点[17]。PSⅡ是植物类囊体膜上的光能吸收和电子传递链的组成部分之一，ATP和NADPH的生成速度和数量均依赖于其活性大小。有关酸雨对植物叶片PSⅡ的影响的报道为数不多，山核桃(Caryacathayensis)叶片光系统Ⅱ反应中心在模拟酸雨胁迫下受到伤害，电子传递受阻[18]，而细叶青冈(Cyclobalanopsismyrsinaefolia)幼苗叶片光系统Ⅱ对模拟酸雨的反应不敏感[19]。而有关桑树叶片PSⅡ对酸雨的响应情况尚不明确，为此，本研究拟采用快速叶绿素荧光动力学技术，探索模拟酸雨对桑树叶片PSⅡ的影响，其包括PSⅡ反应中心对光能的吸收转化，过剩光能的耗散及反应中心的供受体侧电子传递等信息，以期为桑树在酸雨频发地区的栽培管理提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究于2014年4月28日在东北林业大学植物生理实验室酸雨棚中进行，试验品种为一年龄的实生苗“秋雨桑”，由黑龙江省蚕业研究所提供。发芽培育后待供试苗木生长到20 cm时，移栽到直径12 cm、高15 cm的培养钵中，为保证试验材料的相对一致性，在移植时去掉桑树幼苗分支和叶片，只保留主根和主茎各5 cm，每钵定植2株，共计80株。培养基质则由草炭土和蛭石均匀混合而成。待供试苗木生长到30～40 cm时，选用长势一致的桑树幼苗进行模拟酸雨胁迫处理。

1.2 试验处理

本研究共设3个模拟酸雨溶液处理，即重度酸雨(pH 3.5)、中度酸雨(pH 4.5)和清水作为对照(CK)。配置的电解质母液，其包含的主要离子成分及浓度为31.46 mg·L-1NaF、26.28 mg·L-1KCl、74.91 mg·L-1CaCl2、171.28 mg·L-1MgSO4、82.27 mg·L-1NH4Cl。根据黑龙江酸雨检测分析资料[1]，按[SO42-]和[NO3-]比值为1∶3配置酸雨母液，用稀释1 000倍的电解质母液，把酸雨母液分别稀释成pH为4.5和3.5的模拟酸雨。在室外安装接收自然降雨的装置，雨后计算降雨量，并根据实际的降雨量喷施桑树，为排除酸雨对桑树根系的影响，喷施酸雨时用塑料布将盆体覆盖，同时考虑到气孔因素，因此对叶片的正反面均喷施酸雨。喷淋时间为6-8月，总计降雨量360 mm，稍高于黑龙江省近52年来的夏季平均降雨量345 mm[20]。

1.3 石蜡切片制作方法和观察统计方法

在叶片的第5-6一级脉间靠近主脉的位置取材，然后用FAA(38%甲醛、冰醋酸和70%酒精按1∶1∶18体积比混合)固定后，经脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、贴片(粘片剂为Haupt)、脱蜡、复水、1%番红和1%固绿染色、洗涤和脱水、封片干燥后，于光学显微镜(Nikon-E800)镜检和拍照。显微照片用图像分析软件Image Tool 3.0进行处理，测量出上表皮、下表皮、栅栏组织和海绵组织的厚度[21]。

1.4 叶绿素荧光参数的测定

利用Mini调制式掌上叶绿素荧光仪(FluorPen FP 100 max，捷克)于2016年8月末对各组酸雨处理中长势相对一致的10株桑树幼苗(即10次重复)进行测定。将桑树幼苗的第3片完全展开叶片(从上往下数)进行30 min的暗适应后，测定叶片的叶绿素荧光动力学曲线。测定部位选择从叶基部数起的第3与第4叶脉之间，距离主叶脉大约2 cm处。测量数据：原初荧光(Fo)、最大荧光(Fm)、PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)以及通过计算得到暗适应后的PSⅡ的潜在活性(Fv/Fo)等。在OJIP曲线测定过程中，诱导光强为3 000 μmol·(m2·s)-1的脉冲红光，从10 μs开始记录相对荧光强度(Fv),共记录1 s，其中曲线上O、J、I和P点分别表示当时间为0.02、2、30和1 000 ms时曲线上对应的点，利用平均值(10次重复)绘制OJIP曲线。L点表示0.15 ms时曲线上对应的点，K点表示0.3 ms时曲线上对应的点，相对荧光强度分别以FL和FK表示，而L、K、J和I点的相对可变荧光分别以VL、VK、VJ和VI表示，OJIP曲线是按照Strasser和Strasser等[20]的方法JIP-test进行分析。

为特异分析J点和I点的相对可变荧光的变化，将OJIP曲线标准化，即将O点的相对荧光强度(Fo)设为0，而P点相对荧光强度(Fp)设为1，按公式(Ft-Fo)/(Fm-Fo)求得各时间点的相对可变荧光，其中Ft表示各时间点的相对荧光强度。为探究酸雨胁迫对桑树幼苗叶片放氧复合体OEC活性和类囊体解离状态的影响，即K点和L点的相对可变荧光VL和VK的变化，分别将O-J和O-K曲线进行标准化，其计算公式分别为(Ft-Fo)/(FJ-Fo)和(Ft-Fo)/(FK-Fo)。计算模拟酸雨胁迫下处理标准化O-P、O-J和O-K曲线与CK之间的差值，分别用△VO-P、△VO-J、△VO-K表示[22]。

1.5 数据处理和统计方法

运用Excel 2003和SPSS 13软件对所测数据进行统计分析，用平均值±标准差(SD)来表示测定结果，并采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨对桑树叶片形态结构的影响

与CK相比，pH 4.5模拟酸雨处理可促进桑树幼苗生长(图1)，同等叶位的叶面积较CK高20.65%(P<0.05，表1)；而pH 3.5的模拟酸雨处理则明显抑制桑树幼苗的长势，同等叶位的叶面积较CK低28.59%(P<0.01)。叶片叶脉间的区域出现黄色病斑。石蜡切片观察结果显示，pH 4.5与CK的叶片的切面结构相似，栅栏组织和海绵组织细胞结构正常，边缘清晰，而pH 3.5处理桑树叶片石蜡切片，染色颜色较浅，栅栏细胞和保卫细胞结构异常，边缘模糊。定量分析发现，pH 4.5处理桑树叶片上表皮厚度和下表皮厚度分别比CK低10.23%(P<0.05)和18.32%(P<0.01)，栅栏组织的长度和海绵组织长度也分别比CK低1.5%(P>0.05)和1.8%(P>0.05)，并且叶片总体变薄。

2.2 模拟酸雨对桑树叶片质膜和抗氧化酶活性的影响

模拟酸雨处理的桑树叶片质膜透性的相对电导率和膜质过氧化产物MDA含量都有所上升(表2)。定量分析发现，pH 4.5和pH 3.5酸雨处理组的桑树叶片的相对电导率含量分别比CK高28.06%(P<0.01)和47.16%(P<0.01)，而MDA含量分别比CK高16.67%(P>0.05)和33.33%(P<0.01)，说明高强度的酸雨对桑树叶膜损伤的程度逐渐加重。与CK相比，模拟酸雨处理组的桑树叶片含水量分别下降22.25%(P<0.01)和41.86%(P<0.01)。

在不同浓度酸雨胁迫下，叶片中的SOD、POD和CAT活性不同，均表现出随着pH的降低呈先上升后下降的单峰曲线型变化(表2)。定量分析发现，pH 4.5酸雨处理桑树叶片的SOD、POD、CAT分别比CK高6.17%(P<0.01)、1.28%(P<0.01)、14.07%(P<0.01)。而pH 3.5酸雨胁迫时桑树的SOD、POD、CAT分别较CK降低了3.35%(P<0.05)、29.79%(P<0.01)、15.85%(P<0.01)。

图1 模拟酸雨对桑树叶片形态结构的影响Fig. 1 Effect of simulated acid rain on morphological structure of mulberry leaves

指标 Parameter 处理Treatment清水对照Water(CK)pH 4.5pH 3.5叶面积Leaf area/cm2104.6±4.00bA 126.2±11.61aA74.7±1.69cB上表皮厚度Upper epidermis thickness/μm12.80±0.79aA11.49±0.30bA11.22±0.30bA下表皮厚度Lower epidermis thickness/μm8.95±0.26aA7.31±0.27bB8.51±0.46aA栅栏组织厚度Palisade parenchyma thickness/μm18.35±0.28aA18.07±0.60aA-海绵组织Spongy parenchyma thickness/μm29.21±1.59aA28.67±0.29aA-

同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。表2同。

Different lowercase and capital letters within the same row indicate significant differences at the 0.05 and 0.01 level, respectively; similarly for Table 2.

表2 模拟酸雨对桑树叶片质膜氧化和抗氧化酶活性的影响Table 2 Effect of simulated acid rain on plasma membrane and oxidoreductase in leaves of mulberry seedlings

2.3 模拟酸雨对桑树叶片OJIP曲线的影响

不同pH模拟酸雨胁迫改变了桑树叶片OJIP曲线的形态(图2)。其中pH 3.5模拟酸雨处理桑树叶片的O点、J点、I点和P点的相对荧光强度(FO、FJ、FI、Fp)均高于CK，而pH 4.5模拟酸雨处理的O点、J点、I点和P点的相对荧光强度与CK相比均降低。经定量分析发现，pH 3.5模拟酸雨处理的桑树叶片的FO、FJ、FI、Fp较CK分别升高18.45%(P<0.05)、27.04%(P<0.05)、22.07%(P<0.05)和13.93%(P>0.05)；而pH 4.5模拟酸雨胁迫下的桑树叶片FO、FJ、FI、FP较CK分别下降了6.77%(P>0.05)、16.29%(P<0.05)、19.55%(P<0.05)和18.39%(P>0.05)。对OJIP曲线进行标准化处理后，发现pH 3.5模拟酸雨处理的桑树叶片的J点明显高于CK，将模拟酸雨处理组的标准化的OJIP曲线上相对荧光强度与CK作差，pH 4.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的VI和VJ分别较对照降低了3.75%和3.28%，差异均不显著(P>0.05)。pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的VI和VJ较对照增加了8.28%(P<0.01)和14.86%(P<0.05)。pH 4.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片I点的相对可变荧光VI和J点的相对可变荧光VJ较CK降低，而pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片VI和VJ则增幅较大。将pH 4.5和pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片标准化O-P曲线分别与对照做差值能够得出，pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片使VJ的升高幅度大于VI。

图2 模拟酸雨胁迫对桑树幼苗叶片OJIP曲线的影响Fig. 2 Effect of simulated acid rain on OJIP transmission in the leaves of mulberry seedlings

2.4 模拟酸雨对桑树叶片PSⅡ光化学活性的影响

pH 4.5和pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的最大光化学效率(Fv/Fm)和以光吸收为基础的光合性能指数(PIABS)均比CK低(图3)。其中pH 4.5的Fv/Fm较CK降低了5.46%(P<0.01)，PIABS较CK降低了2.74%(P>0.05)；pH 3.5模拟酸雨的最大光化学效率Fv/Fm较CK降低了4.67%(P<0.01)，PIABS较CK显著降低了53.91%(P<0.05)。Fv/Fm和PIABS均是反映植物光抑制的重要指标，因此可以得出，pH 4.5和pH 3.5模拟酸雨均对桑树幼苗叶片的光合性能造成了损害。pH 4.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片较CK的QA 被还原的相对速率(Mo)略低了12.14%(P>0.05)，而pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的Mo升高幅度为60.76%(P<0.01)。pH 4.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的荧光曲线和Fm之间的面积Area较CK的下降了15.12%(P<0.05)，说明pH 4.5的模拟酸雨对于桑树叶片PSⅡ的抑制位点可能在于供体侧。而pH 3.5处理的较CK升高了11.78%(P<0.05)，说明pH 3.5模拟酸雨胁迫对桑树幼苗叶片PSⅡ抑制位点可能在于受体侧。

图3 模拟酸雨对桑树叶片光化学效率Mo、Fv/Fm、PIABS和Area的影响Fig. 3 Effect of simulated acid rain stress on Mo, Fv/Fm, PIABS, and area in the leaves of mulberry seedlings

2.5 模拟酸雨对桑树叶片标准化OJ和OK曲线的影响

模拟酸雨处理改变了桑树叶片L点和K点的相对荧光强度(图4)，其中pH 4.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的FL和FK与CK相比分别降低了10.40%和13.71%，差异均不显著(P>0.05)；pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的FL和FK较对照分别升高了41.02%和45.34%，并且各处理之间具有极显著的差异(P<0.01)。分别将O-K和O-J曲线标准化后可以发现，pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片标准化O-K曲线上0.15 ms时即K点的相对可变荧光(VK)以及标准化O-J曲线上0.3 ms时即L点的相对可变荧光(VL)与CK相比差异明显。分别将标准化O-K和O-J曲线与CK作差值可以发现，K点的相对可变荧光与CK之间差异最明显，而L点的相对可变荧光与CK之间则并未达到最大差值。由定量分析可知：pH 4.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的VL和VK分别较CK降低了1.91%和4.14%，差异不显著(P>0.05)；而pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的VL和VK分别较CK增加了83.19%和61.45%，差异极显著(P<0.01)。

3 讨论

植物细胞受到胁迫时，活性氧往往会与之增加，植物体内保护酶类如SOD、CAT和POD等在低强度的胁迫下，其活性上升用于清除增加的活性氧；而高强度的胁迫下，大量的活性氧直接破坏生物大分子包括保护酶[23]。在本研究中，pH 3.5的模拟酸雨处理的桑树叶片相对电导率和MDA含量显著上升，而3种保护酶活性则显著下降；pH 4.5的模拟酸雨处理的桑树叶片保护酶POD、SOD和CAT的活性显著高于CK，相对电导率和MDA含量明显低于CK。由此，pH 4.5的模拟酸雨使桑树自身保护酶的活性提高，清除活性氧，避免膜质过氧化。胡月等[9]发现,pH 4.5的模拟酸雨可促进桑树叶光合性能，通过提高水分利用效率，缓解桑树叶片的光合午休，使得日同化量显著增加。但在本研究中,pH 4.5处理的面积增大，但桑树叶片含水量显著低于CK，同时，石蜡切片的结果显示，pH4.5处理的桑树叶片上下表皮厚度以及栅栏组织和海绵组织的长度均低于CK，说明叶片变薄。通常情况下植物营养过剩会出现叶面积增大，叶片变薄的症状[24]。而pH 3.5处理的桑树叶片失绿发黄，叶片面积和含水量显著低于CK，石蜡切片结果显示，上下表皮厚度高于CK，但二者之间的栅栏组织和海绵组织长度变小，间隙增大，边缘不清晰，同时染色发红，说明该处理叶片已衰老并木质化，前期研究发现，pH 3.5处理的桑树叶片光合午休程度加重，且光合气体交换参数明显下降，尤其水分供应和运输受到抑制。但对于光合电子传递的影响尚不明确[9]。

图4 模拟酸雨对桑树幼苗叶片标准化OJ和OK曲线的影响Fig. 4 Effect of simulated acid rain on standard OJ and OK transmission in the leaves of mulberry seedlings

叶绿素荧光与光合作用密切相关，任何环境因子对植物光合作用的影响都可以通过叶片的叶绿素荧光动力学来反映[9]。植物光合作用受到抑制首先影响的是PSⅡ，PSⅡ在逆境下的响应机制被认为是植物光合作用适应逆境最重要的生存策略。光合速率的下降，必然会影响植物对光能的吸收、传递和转化，其中最主要的表现是光化学活性下降[25]。PSⅡ的光化学效率(Fv/Fm)和以光吸收为基础的光合性能指数(PIABS)是研究植物光合生理状态的重要参数[26-27]。pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片Fv/Fm和PIABS均显著低于CK。说明pH 3.5模拟酸雨对桑树幼苗叶片的光合性能造成了损害。快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)以及其荧光参数可深入分析桑树幼苗在酸雨胁迫条件下的PSⅡ结构、功能以及光化学活性的变化情况。为分析桑树光合作用中电子传递链上各个电子传递位点对模拟酸雨的响应，本研究将不同pH 模拟酸雨处理后的桑树叶片OJIP曲线按O-P标准化后特异分析了L、K、J点和I点的相对可变荧光变化。K点的出现是由于放氧复合体受损，限制电子供体到次要电子供体Yz的电子传递，使从供体侧进入反应中心和离开反应中心到受体侧的电子不平衡[28]，所以K点可作为放氧复合体(OEC)受伤害的一个特殊标志[29-30]。OEC是PSⅡ反应中心氧化端最主要的结构单元，其破坏程度对植物光合作用中的水裂解和电子传递产生影响[31]。而OJIP曲线上L点(0.15 ms)的相对可变荧光(VL)上升则是类囊体解离的特异性标志[32]。类囊体膜上含有光合色素和电子传递链组分，光反应在此上面进行，因此，类囊体的解离会造成叶片光系统功能的破坏，进而降低光合作用。荧光参数中的Mo用于表示QA被还原的相对速率，在本研究中，pH 3.5模拟酸雨处理桑树叶片的Area较对照显著上升，Area增加意味着PSⅡ电子传递链受体侧可能受到抑制[33-35]，同时Mo增加，表示PSⅡ电子传递链受体侧QA-以后的电子传递受到抑制。VJ代表J点所具有关闭反应中心的数量，即QA-的积累量，而VJ的增加则是在去镁叶绿素(Pheo)将电子传递给QA生成QA-以后，电子由QA-向QB的传递过程受到抑制所致。VI的变化则反映电子由QA-向QB传递过程中PQ库的异质性[36]。本研究中，pH 3.5模拟酸雨处理的桑树幼苗叶片的VI和VJ较对照均显著增加，在此表明在pH 3.5模拟酸雨胁迫下电子传递链受阻位点是QA向QB处。同时，PQ库接受电子的能力下降。此外，该处理的桑树幼苗叶片的VK和VL与CK相比显著升高，说明pH 3.5模拟酸雨处理抑制了OEC的活性，同时类囊体稳定性降低，破坏了PSⅡ的光化学活性。虽然，pH 4.5处理的桑树叶片的Fv/Fm和Area较CK显著下降，但电子传递链受体侧和供体侧的特征参数VI、VJ、VK和VL均与CK差异不显著，再根据形态、长势和组织结构分析，pH 4.5处理的桑树叶片的PSⅡ结构和功能未受到模拟酸雨胁迫的影响。

4 结论

pH 3.5的模拟酸雨沉降抑制了PSⅡ电子传递链受体侧OEC的活性以及受体侧QA向QB的电子传递，导致桑树幼苗叶片的光合性能下降，抑制了桑树幼苗的生长；pH 4.5模拟酸雨并未影响PSⅡ的结构和功能，并且在某种程度上有利于桑树幼苗的生长。本研究结果表明，桑树能够忍受并适应pH≥4.5的酸雨胁迫，可在轻度酸雨沉降地区作为园林绿化、退耕还林及植被构建的经济树种进行大面积栽植。