应用Rusitec-S系统研究甘露寡糖对绵羊体外瘤胃发酵的影响

张 然，郑 琛，韩海珠，雒瑞瑞，李彦珍，朱 伟

(甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

甘露寡糖(mannan oligosaccharides，MOS)作为功能性寡糖的一种，广泛存在于魔芋粉、瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁内，有低热、稳定、用量少、无残留、安全无毒等理化性质，被称为“化学益生素”，是最有希望的抗生素替代品之一。有研究表明，饲粮中添加甘露寡糖能在改善动物肠道微生态环境的同时提高免疫力[1-2]和生产性能[3-4]，因此，深入研究甘露寡糖在动物生产中的应用具有重要意义。国内外对甘露寡糖的研究不论是基础理论还是生产实践应用方面，多限于仔猪、家禽等单胃动物，也多集中在消化道后肠段，对反刍动物瘤胃发酵特性和饲料瘤胃降解率的研究较少[5]。反刍动物的瘤胃可看作是一个厌氧性微生物接种和繁殖的活体发酵罐[6]，在大量体外模拟瘤胃发酵的装置中，可实现连续培养的Rusitec-S型人工瘤胃模拟装置更接近活体内瘤胃发酵的真正情况[7]。本研究采用Rusitec-S型人工瘤胃模拟装置来研究饲粮中添加不同水平的甘露寡糖对绵羊瘤胃发酵特性的影响，以期为甘露寡糖在绵羊养殖中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甘露寡糖购自北京奥特奇生物制品(中国)有限公司，从酿酒酵母细胞中提取，有效成分含量大于90%。

1.2 试验动物与饲养管理

提供瘤胃液的动物为5只装有永久瘤胃瘘管的健康杂种羯羊(白萨福克♂×小尾寒羊♀)，体重为(30.00±2.15) kg，参照中华人民共和国农业行业标准肉羊饲养标准(NY/T816-2004)中育成公羊营养需要量(体重30 kg，日增重200 g)，配制甘露寡糖含量较低的饲粮，饲粮精粗比为40∶60，其组成及营养水平如表1所列。

表1 基础饲粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet

预混料为每千克饲粮提供Fe 38 mg，Zn 44 mg，Cu 15 mg，I 0.5 mg，Mn 50 mg，Se 0.3 mg，Co 0.05 mg，VA 354 IU，VD 94.4 IU，VE 1.06 mg；消化能为计算值，其余为实测值，均以干物质为基础计算。

The premix provided the following per kg of the diet: Fe 38 mg, Zn 44 mg, Cu 15 mg, I 0.5 mg, Mn 50 mg, Se 0.3 mg, Co 0.05 mg, VA 354 IU, VD 94.4 IU, VE 1.06 mg; DE was a calculated value, while the others were measured values, and calculated based on dry matter.

1.3 试验设计

采用单因素完全随机试验设计，甘露寡糖的添加水平分别为0、0.8%、1.6%和2.4%，Rusitec-S 系统的8个发酵罐分为4个处理组，每个添加量两个发酵罐，连续进行两期试验，即每个处理组有4个重复。每期试验的试验期为9 d，前7 d为人工瘤胃系统稳定期，最后2 d为采样期。

1.4 人工瘤胃培养流程

1.4.1人工瘤胃缓冲液的配制 人工瘤胃缓冲液的配制参照McDougall[8]的配方。

1.4.2人工瘤胃装置 人工瘤胃(Rusitec-S)购自Sanshin工业有限公司(东京，日本)，试验条件：缓冲液流量为0.39 mL·min-1，流出液口筛网孔径为1.2 mm，搅拌机搅拌频率为4～5 次·min-1，发酵罐内温度为39 ℃，通入CO2至厌氧环境[9]。

1.4.3人工瘤胃操作方法 晨饲前从5只杂种羯羊瘤胃内的不同部位采集足量瘤胃食糜和瘤胃液，经4层纱布分离固体和液体部分。瘤胃液灌入已经预热并通有CO2的保温瓶中，灌满后立即盖严瓶口，迅速转移到实验室并且分装到已安装好水槽(温度设定在39 ℃)的8个发酵罐中，每个发酵罐中装入400 mL瘤胃液和等体积的缓冲液。然后称取70 g(湿重)固体食糜装进尼龙袋(规格7 cm×13 cm、孔径38 μm)。在每个发酵罐中放入两个尼龙袋(一个装有试验饲粮，另一个装有固体食糜)。24 h后，从发酵罐中移出装固体食糜的尼龙袋，同时放入一个新的装有饲粮的尼龙袋。此后每天移出一个已培养48 h的尼龙袋,同时放入一个新的装有饲粮的尼龙袋，所有操作在30 min内完成。

1.4.4样品采集 采样期第1天用集气袋收集培养24 h的气体；采样期第2天，于换料后收集各个发酵罐中的尼龙袋，立即在自来水下冲洗，然后放入水中浸泡45 min，再在中等流速的自来水下漂洗后将尼龙袋65 ℃烘干，残渣用于测定干物质、有机物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和粗蛋白质含量。同时于换料后0、3、6、9和12 h收集20 mL发酵液，按瘤胃液容积的1/100加入饱和HgCl2溶液，立即测定pH，然后置于-20 ℃冷冻保存，用于测定总氮、氨氮、尿素氮和挥发性脂肪酸含量。

1.5 测定指标及方法

pH用酸度计(PHS-3C，上海雷磁仪器厂)测定，产气量用气体流量计(DC-1，Shinagawa，日本)测定，甲烷和挥发性脂肪酸含量用气相色谱仪(6890N，Agilent，美国)测定，瘤胃液总氮用凯氏定氮法测定[10]，瘤胃液氨氮用比色法[11]测定，瘤胃液尿素氮用二乙酰-肟法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

瘤胃液蛋白氮(mg·dL-1)计算公式：

瘤胃液蛋白氮=瘤胃液总氮-瘤胃液氨氮-瘤胃液尿素氮。

饲粮及食糜中干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别按照杨胜[10]和van Soest等[12]的方法测定。按下式计算各养分的瘤胃降解率(%)：

瘤胃降解率=[(原尼龙袋内的营养物质含量-48 h降解后尼龙袋内营养物质含量)/原尼龙袋内的营养物质含量]×100%。

1.6 数据统计分析

试验数据采用Excel软件进行初步统计处理，并采用SPSS 19.0软件包对试验数据进行单因素方差分析，差异显著时，采用Tukey法(方差齐) 或Tamhane法(方差不齐)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 体外产气量和甲烷产量

甘露寡糖对总产气量和甲烷产量均未产生显著影响(P>0.05)，但随着甘露寡糖添加水平的提高，甲烷产量略有降低。

表2 体外产气量和甲烷产量Table 2 Gas and methane production in rumen fermentation in vitro

2.2 体外养分降解率

饲粮中添加甘露寡糖对各养分的体外降解率均未产生显著影响(P>0.05)，也未表现出规律性的变化。

2.3 体外发酵液氮浓度

甘露寡糖添加水平对总氮、氨氮、尿素氮和蛋白氮浓度均未产生显著影响(P>0.05)(表4)。

2.4 体外发酵液pH和挥发性脂肪酸浓度

甘露寡糖添加水平对pH、总挥发性脂肪酸浓度、乙酸/丙酸、乙酸、丙酸、丁酸和其他酸比例均未产生显著影响(P>0.05)(表5)。

表3 体外养分降解率Table 3 Nutrients degradation rate in rumen fermentation in vitro

表4 体外发酵液氮浓度Table 4 Nitrogen concentration in rumen fermentation in vitro

3 讨论

3.1 饲粮中添加甘露寡糖对体外产气量和甲烷产量的影响

产气量是反映饲料可发酵程度及瘤胃微生物活性的重要指标。有研究表明，饲料中可发酵的有机物含量越多，瘤胃微生物的活性越强，产气量就越大，反之，则产气量减少[13]。氢气还原二氧化碳是形成甲烷的主要途径，其次乙酸、甲酸和丁酸等挥发性脂肪酸也能合成甲烷[14]。曾燕霞[15]在研究不同精粗比日粮中添加甘露寡糖对绵羊体外发酵影响时发现，甘露寡糖的添加水平对体外产气量和甲烷产量均未产生显著影响；本研究结果与其一致，添加甘露寡糖组的总产气量高于未添加甘露寡糖组，添加甘露寡糖组的甲烷产量低于未添加甘露寡糖组，但均未产生显著差异。这可能是由于甘露寡糖添加水平较低(最高2.4%)导致瘤胃微生物利用甘露寡糖发酵的作用不明显，也可能是因为体外发酵装置、寡糖种类及添加量、瘤胃液来源或饲粮组成等不同造成试验结果差异，具体原因还需要进一步研究。

3.2 饲粮中添加甘露寡糖对体外养分降解率的影响

本研究中，各处理组间干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解率均差异不显著，与张爱忠[16]和Mwenya等[17]的研究结果类似。这可能是由于营养物质的消化率主要由营养物质的理化性质决定，益生元并不能改变日粮营养物质的消化率，只能改变细菌的数量从而影响纤维的降解率[18]，如靳露[19]研究表明，在基础日粮中添加2%的甘露寡糖，对肉牛日粮干物质、有机物、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的养分表观消化率无显著影响。有相关研究认为[20-22]，外源添加功能性寡糖可以提高纤维素分解菌的活性和数量，改善绵羊瘤胃微生物区系，加速饲料中碳水化合物，尤其是纤维类物质的降解，提高干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率。例如林英庭等[20]、刘兵等[23]发现，添加寡糖可提高绵羊常用粗饲料干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维瘤胃降解率，这可能是由于不同功能性寡糖对绵羊体外养分降解率的影响效果不同。

表5 体外发酵液pH和挥发性脂肪酸浓度Table 5 The pH and volatile fatty acid concentrate in rumen fermentation in vitro

3.3 饲粮中添加甘露寡糖对体外发酵液氮浓度的影响

瘤胃液总氮主要包括饲粮粗蛋白质降解和再循环进入的氨氮、尿素氮和蛋白氮等。饲粮蛋白质经瘤胃细菌和蛋白酶的协同降解被消化利用，任何细菌或酶活性的改变都会影响饲粮蛋白质的降解。有研究表明，饲粮中添加甘露寡糖可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌群的增殖，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌的生长，改善动物胃肠道微生态环境[2,24]。本研究中，甘露寡糖对体外发酵液总氮、氨氮、尿素氮和蛋白氮浓度均没有显著影响。推测原因可能是，甘露寡糖的添加量不足以促进瘤胃内有益菌的增殖，进而影响瘤胃微生物对甘露寡糖的利用情况；也可能是因为甘露寡糖在反刍动物瘤胃内被瘤胃微生物降解，而这种降解作用可能导致添加外源寡糖对反刍动物效果甚微。Owens等[25]指出，饲粮中蛋白质来源的差异、碳水化合物底物的变化以及粗饲料的加工方式都会影响瘤胃微生物的合成与代谢。

3.4 饲粮中添加甘露寡糖对体外发酵液pH和挥发性脂肪酸浓度的影响

pH是评价瘤胃代谢的重要指标，主要受日粮性质、唾液分泌量和有机酸积累的影响，它决定着瘤胃微生物对底物的发酵利用情况[26]。瘤胃内pH的变动范围在5.5～7.5[27]。本研究中，各处理组不同时间点培养液的pH在7.01～7.17，在有利于微生物发酵的范围内，是因为Rusitec-S型人工瘤胃发酵罐中瘤胃液和缓冲液的比例为1∶1，且缓冲液按一定流速不断流入发酵罐及终产物不断排出造成的。肖宇等[28]报道，功能性寡糖都有降低奶山羊瘤胃pH的作用，半乳甘露寡糖与甘露寡糖的效果尤为明显。刘光斌等[29]在采用体外批次培养法研究大豆寡糖对生长绵羊瘤胃发酵特性的试验中也表明，饲粮中添1.2%、1.6%和2.0%的大豆寡糖可以显著降低瘤胃pH。本研究同一时间各处理组间pH差异均不显著，这可能是甘露寡糖对瘤胃微生物的调控作用相对缓慢从而避免了pH出现较大波动[5]。

挥发性脂肪酸的浓度和比例能够反映瘤胃营养摄入情况[30]。本研究中，甘露寡糖对总挥发性脂肪酸浓度、乙酸/丙酸、乙酸、丙酸、丁酸和其他酸的比例均没有产生显著的影响。这可能是因为甘露寡糖添加水平较低，不能显著影响到每种脂肪酸的含量，或是添加甘露寡糖后产生的能量不足以为纤维分解菌提供能量，从而影响纤维分解菌的活性和数量。本研究与郑琛等[5]的研究结果类似。活体研究表明，外源添加甘露寡糖除对食前试羊瘤胃液丁酸百分比产生极显著的影响外，对试羊瘤胃液总挥发性脂肪酸浓度、乙酸、丙酸、丁酸和其他酸百分比及乙酸/丙酸均没有产生显著影响[5]。但凌宝明等[31]利用营养灌注技术研究了果寡糖对生长绵羊瘤胃发酵功能的影响，显示出灌注果寡糖可提高培养液中的挥发性脂肪酸含量，认为可能是添加果寡糖后增加了产生挥发性脂肪酸的来源，或是果寡糖作为益生元促进了瘤胃内双歧杆菌及其他某些细菌的增殖，增强了瘤胃细菌对可发酵碳源的降解能力。

4 结论

本研究中，在Rusitec-S人工瘤胃培养条件下，添加甘露寡糖对体外培养液pH、总挥发性脂肪酸、总氮、氨态氮、尿素氮和蛋白氮浓度以及乙酸/丙酸与乙酸、丙酸、丁酸、其他酸比例、养分降解率及甲烷产量和总产气量均没有显著影响，表明甘露寡糖对体外瘤胃发酵影响不大。