含乳食品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸的检测

郭有辉，杨艳秋，胡露，唐懋，王丽娜，叶梅

（成都市食品药品检验研究院，成都 610100）

0 引 言

随着国民生活质量的提高，食品安全问题日益受到全社会广泛关注。动物水解蛋白是以动物皮革中的胶原蛋白为原料，水解精制而成的产物，此类物质加入到食品中会带来潜在的危害。在乳及乳制品中添加动物水解蛋白的主要目的是为了降低成本，以提高产品含氮量，追求利润而添加。因此，区分乳蛋白和动物水解蛋白显得尤为重要。

目前用于测定动物水解蛋白L-羟脯氨酸的方法主要有分光光度法和高效液相色谱法，但这两种方法操作繁杂，水解时间过长，不适合大批量样品的分析。

本实验参考了相关文献[4-8]。对试样中羟脯氨酸的水解方法进行了改进和优化，通过改进的硫酸溶液烘箱恒温水解法缩短了分析时间，操作安全简单，并且适用于大批量实验操作。

1 实 验

1.1 材料

乳粉、乳饮料、灭菌乳、猪皮胶原蛋白粉（市售）。

1.2 试剂

硫酸，氢氧化钠，柠檬酸，结晶乙酸钠，正丙醇，氯胺T，对二甲氨基苯甲醛，高氯酸，L(-)-羟脯氨酸（Aifa Aesar)。本研究所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计，酸度计，电热恒温鼓风干燥箱。

1.4 方法

1.4.1 实验原理

试样经硫酸于120℃水解释放出L(-)-羟脯氨酸，经氯胺T氧化、生成含有吡咯环的氧化物，用高氯酸破坏过量的氯胺T，L(-)-羟氨酸氧化物与对二氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在558 nm波长处测定吸光度，并与标准曲线系列比较定量。

1.4.2 试剂配制

硫酸溶液（6 mol/L）：量取约500 mL于1 L容量瓶中,在搅拌下缓慢加入320 mL浓硫酸(ρ=1.84 g/mL),冷却后用水定容；

缓冲溶液(pH值为6.8)：分别准确称取26.0 g一水柠檬酸，14.0 g氢氧化钠，78.0 g三水乙酸钠，用500 mL水溶解上述试剂并转入1 L的容量瓶中，加入250 mL的正丙醇，用水定容；

氯胺T：准确称取1.41 g三水·N－氯－对甲苯磺酰胺钠盐(氯胺T)，加入100 mL缓冲溶液溶解，临用前配置；

显色剂：称取10.0 g对二甲基苯甲醛，用35 mL高氯酸溶液（60%）溶解，缓慢加入65 mL异丙醇，临用前配置；

羟脯氨酸标准储备液：称取50 mg 4－羟基－α－吡咯甲酸(羟脯氨酸)于100 mL容量瓶，用水溶解加入一滴硫酸溶液，用水定容，此标准储备液质量浓度为500μg/mL；

氢氧化钠溶液（浓度10 mol/L，1 mol/L）；

羟脯氨酸标准工作液5.0μg/mL：吸取标准储备液5.00 mL于500 mL容量瓶中定容。

1.4.3 样品前处理

称取液体样品5.0 g（固体样品1.0 g加水至5.0 g左右)至100 mL具塞比色管或具塞三角瓶中，加入25 mL浓度为6 mol/L的硫酸溶液，盖上塞子，放入恒温干燥箱中，120℃恒温水解4 h。趁热将水解产物转移至200 mL容量瓶中，用10 mL硫酸容液分三次洗涤具塞比色管或具塞三角瓶，合并洗液至上述容量瓶中。用水定容，摇匀，所得滤液为样品水解液。

吸取25.0 mL水解液于100 mL烧杯中,用浓度为10 mol/L和1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为8±0.2，过滤于100 mL容量瓶中，用水冲洗烧杯和滤纸上的氢氧化亚锡沉淀，反复3次，把洗液并入滤液中，以水洗到刻度，摇匀备用。同时做空白试验。

1.4.4 试样测定

吸取 L(-)-羟脯氨酸标准工作液 0.00，10.00，20.00，30.00，40.00，50.00 mL；分别置于100 mL容量瓶中，摇匀定容。标液质量浓度分别为0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL。分别准确吸取4.0 mL制备好的滤液和不同质量浓度的L(-)-羟脯氨酸标准工作液于25 mL具塞比色管中，加氯胺T溶液2.0 mL，摇匀后于室温放置20 min。加入显色剂2.0 mL，充分混匀后，迅速将比色管放于入60℃恒温水浴中保温20 min后取出，流水浴迅速冷却比色管，在波长558 nm处测定吸光值,绘制标准曲线，样品以扣除了空白溶液的吸光值，从所得的标准曲线查找对应的浓度，然后计算出样品中羟脯氨酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 标准工作曲线绘制

本方法的标准曲线以扣除试剂空白的标准溶液的吸光度为纵坐标，以相应的标液浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y=0.208X+0.000，R2=0.999。由图1可以看出，表明标准样品溶液的吸光度Abs和羟脯氨酸的浓度之间存在很好的相关性。

2.2 实验水解条件选择

3个掺加3%，5%，10%猪皮胶原蛋白粉的乳粉样品各26组分别采用浓度为3 mol/L和6 mol/L的硫酸溶液在120℃恒温烘箱中水解样品，水解不同时间测得的羟脯氨酸质量浓度检测结果如表1所示；采用浓度为6 mol/L的硫酸溶液在不同温度的恒温烘箱中水解样品4 h测得羟脯氨酸的质量浓度检测结果如表2所示。

图1 L-羟脯氨酸标准工作曲线

表1 不同水解时间测得羟脯氨酸质量分数结果 mg/g

表2 不同温度下水解样品测得羟脯氨酸质量分数结果 mg/g

结果表明，使用3 mol/L硫酸溶液水解样品，样品A使用3 mol/L硫酸溶液水解在6 h后测得的羟脯氨酸质量浓度变化不大，样品B、C使用3 mol/L硫酸溶液水解在8 h也不能判定是否水解完全，而使用6 mol/L硫酸溶液水解时间超过4h三个样品测得的羟脯氨酸质量浓度变化不大，水解反应完全 。使用6 mol/L硫酸溶液在不同温度下水解样品4 h测定结果表明，样品在120℃水解后测定结果基本趋于稳定，水解反应完全。依据表1、表2的试验数据，及考虑方法适用的宽泛性（满足不同羟脯氨酸含量的样品），样品水解的硫酸溶液浓度选用6 mol/L，而水解时间选为4 h，水解温度选为120℃。

2.3 试样水解方法的改进优化

目前国内实验室通常采用的由中国检验检疫科学院提供的“乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定—L（-）-羟脯氨酸含量的测定”文献方法。但是该方法中提供的两种试样处理方法均有不尽人意的地方，方法分析时间长、操作繁琐、不适合批量操作。本方法对试样的水解方法进行了改进优化，实验采用硫酸溶液代替盐酸溶液水解。因为盐酸易挥发，所以其水解的时候必须用水浴加热冷凝回流装置，而水浴加热不适用于大批量操作，而硫酸溶液不易挥发所以采用烘箱恒温替代水浴加热回流，同时将烘箱的温度提升到120℃，恒温水解时间缩短到4 h。

2.4 检测方法比较

取乳粉、乳饮料、灭菌乳及掺加3%，5%，10%猪皮胶原蛋白粉的乳粉样品。分别采用本方法与中国检验检疫科学院提供的文献方法[2]及肉制品国标法[1]三种检测方法同时进行L-羟脯氨酸测定，测定结果见表3。

表3 3种检测方法测定结果比较 mg/g

由表3可以看出，未掺加猪皮胶原蛋白粉的乳粉，乳饮料，灭菌乳样品三种检测方法均未检出，结果一致。掺加猪皮胶原蛋白粉的样品三种检测方法测定结果基本一致，相对偏差都小于10%。乳粉中羟脯氨酸质量浓度与胶原水解蛋白的质量浓度呈正相关，羟脯氨酸质量浓度变化可以反映乳粉中掺加的猪皮胶原水解蛋白粉的情况。文献[2]中报道羟脯氨酸约占胶原蛋白氨基酸总量的10%左右，本实验中实际掺加的猪皮胶原水解蛋白粉的质量分数分别为3%，5%，10%；经本实验测得羟脯氨酸的质量浓度换算，得到该猪皮胶原蛋白粉的羟脯氨酸质量分数分别为10.2%，11.0%，10.5%；与文献[2]中报道吻合。实验表明本方法适用于含乳食品中L(-)-羟脯氨酸质量分数的测定。

2.5 方法测定低限

控制相同的实验条件，以消除系统误差的空白样品作为测定对象，进行重复测定20次，得到空白的吸光度。同样的实验条件下以5μg/g标准样品作为测定对象，重复测定得到标准样品的吸光度。通过计算得到方法的测定低限为50μg/g。

2.6 方法准确度的实验

本实验准确度采用加标回收实验，称取1.0 g混合均匀后的乳粉样品，加入方法测定低限(50μg)、两倍方法测定低限(100μg)、十倍方法测定低限(500μg)的L-羟脯氨酸标准物质，然后按本方法1.4进行处理后测定，其样品加标回收实验结果如表4所示。

表4 加标回收实验结果 μg

实验表明样品加标回收率为92.4%～96.2%，满足GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测附录F检测方法确认的技术要求[3]，表明本实验完全满足检测方法确认的准确度要求。

2.7 方法精密度实验

按试验方法，平行测定3个加入羟脯氨酸标准物质的乳粉样品重复测定10次。对测定结果进行数据处理，计算出标准偏差S和变异系数CV%，考察该方法的精密度，结果如表5所示。

表5 精密度实验测定结果 μg

由表5可以看出，本方法测定羟脯氨酸的标准偏差S为0.75～4.03，变异系数CV为1.6%～2.5%，方法精密度较高。满足GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测附录F检测方法确认的技术要求[3]，表明本研究完全满足检测方法确认的精密度要求。

3 结论

本实验建立了快速、准确测定含乳食品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸的检测方法。方法测得的回收率在92.4%～98.2%之间，相对标准偏差RSD为3.95%。本研究方法准确度，精密度均满足GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测附录F检测方法确认的技术要求。结果表明，方法操作简单安全、准确度高、精密度好、缩短了检测周期，可大批量操作。解决了通常实验室采用方法中的批量操作不适用以及分析时间过长的问题。方法能够满足含乳食品中的动物水解蛋白L（-）-羟脯氨酸含量的测定，以判定食品中是否添加了动物水解蛋白，为食品安全提供保证。