蚕丝丝素酪氨酸残基的偶合修饰与工艺调控

杨海伟， 王宗乾， 徐晶晶， 王明荣， 王邓峰

安徽工程大学 纺织服装学院， 安徽 芜湖 241000)

蚕丝丝素蛋白含有18种α-氨基酸，其中酪氨酸成分的质量分数高达10.84%[1]，且酪氨酸残基主要分布在丝素蛋白的无定形区和结构表面，易受化学试剂的进攻和作用[2-3]，具有较高的反应可及度，是丝素蛋白化学修饰的重要位点。目前，对丝素蛋白的化学修饰主要为对氨基、酚羟基结构的酰化修饰，对氨基、羧基结构的烷基化修饰，对酚羟基的氧化修饰，以及对残基中芳香环的取代反应修饰[4-5]。其中，酪氨酸残基结构中，因酚羟基的电子诱导效应，苯环酚羟基邻位碳极易发生芳环取代反应，该芳环取代修饰是丝素蛋白典型的特征修饰反应，极少受到其他反应位点的影响[6]。若采用芳胺重氮盐对丝素蛋白进行化学修饰将生成偶氮化合物，该修饰反应也被称为偶合修饰反应，且该修饰反应主要针对酪氨酸残基[7]。酪氨酸残基的化学修饰现已被广泛应用于蛋白质的标记与定量分析领域，如Cserep G. B.等[8]、Jakubowski等[9]等为标记和定量分析蛋白质样品，分别采用Pd(II)、碘分子对不同蛋白质中的酪氨酸残基进行化学修饰，并基于光谱特征实现了蛋白质的标记与分析；Pereira Navaza A等[10]通过IPy2BF4(二吡啶四氟硼化碘)试剂修饰酪氨酸残基，实现了对蛋白质样品的标记，并基于高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)检测技术完成了对修饰蛋白质的定量分析。此外，Neel S. Joshi等基于了三组分曼尼希反应、重氮偶合反应机制对含酪氨酸残基的小分子蛋白质及多肽进行了化学修饰和标记[11-12]。Chen W等[13]将酪氨酸残基的偶合修饰应用在蚕丝纤维的染色领域，采用不同结构的芳胺化合物重氮盐实现对蚕丝酪氨酸残基的偶合修饰染色，修饰后蚕丝具有较高的耐洗和耐摩擦色牢度，丰富了蚕丝纤维的染色技术；同样基于酪氨酸残基偶合修饰反应性能，将紫外线吸收结构修饰到了蚕丝的酪氨酸残基上，提高了蚕丝的耐光稳定性能[14]。

综上所述，丝素蛋白酪氨酸残基的偶合化学修饰条件较为温和，反应速率快，重氮组分与丝素蛋白之间形成共价修饰，具有较高的湿处理牢度，在蛋白的染色与功能化改性方面具有广阔的应用前景。目前较少关于蚕丝丝素酪氨酸残基参与偶合修饰的工艺因素与调控规律的研究报道，也缺少关于该修饰反应吸附速率曲线与吸附等温线的相关报道。为此，本文以偶合修饰后蚕丝丝素的颜色深度K/S值为衡量指标，分析了碱预处理、重氮盐组分的用量、时间、pH值、浴比等工艺参数对邻硝基苯胺重氮盐修饰酪氨酸残基的影响规律，同时研究了重氮盐对酪氨酸残基偶合修饰的吸附速率曲线、吸附等温线类型等内容，以期为丝素蛋白的化学修饰及其性能调控提供实验基础。

1 实验部分

1.1 实验材料与化学药剂

蚕丝织物(78 g/m2，淄博大染坊丝绸公司提供)。实验前，该蚕丝织物经质量分数为0.5%的Na2CO3溶液煮沸脱胶2次，每次各30 min，脱胶浴比为1∶50，脱胶后蚕丝视为蚕丝丝素纤维。

药品：邻硝基苯胺、亚硝酸钠、无水碳酸钠、36%浓盐酸、尿素、氢氧化钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠(上海阿拉丁试剂有限公司)，均为分析纯。

1.2 主要实验仪器

Rapid L-12 A-1型水浴恒温振荡器(厦门瑞比精密机械有限公司)；HJ-5型多功能搅拌器(金坛市杰瑞尔有限公司)；UV2600型紫外-可见分光光度计(上海天美公司)；Datacolor650型测色配色仪(美国Datacolor公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90型粒度及电位分析仪(英国马尔文公司)。

1.3 蚕丝丝素纤维织物的碱预处理

为对比测试碱预处理对蚕丝丝素蛋白偶合修饰的影响，偶合修饰实验前1 h内，采用浸轧工艺对蚕丝丝素纤维进行碱预处理。具体工艺为：室温下织物先经10 g/L的Na2CO3溶液浸渍30 min，浴比为1∶100，之后进行浸轧，控制织物带液率为100%。

1.4 蚕丝丝素的偶合修饰

参照文献[15]制备邻硝基苯胺重氮盐，并配制不同pH值的缓冲溶液；然后在相同工艺条件下，分别对碱预处理与未处理的蚕丝丝素纤维进行偶合修饰，分析了碱预处理、重氮盐组分用量、pH值、时间等工艺参数对偶合修饰蚕丝丝素纤维K/S值的影响规律。

1.5 邻硝基苯胺重氮盐标准曲线的建立

为测试蚕丝丝素蛋白偶合修饰的吸附速率曲线与吸附等温线，首先建立了邻硝基苯胺重氮盐的标准曲线，如图1所示。标准曲线的回归方程式为Y=7.331 33X+0.008 93，线性相关系数R2为0.993 66，邻硝基苯胺重氯盐浓度范围为0.03～0.18 mmol/L。式中：Y为波长278 nm下的光度值；X为邻硝基苯胺重氮盐的浓度，mmol/L。

1.6 测试方法

1.6.1修饰蚕丝丝素纤维的K/S值测试

采用测色配色仪测试修饰蚕丝丝素纤维的K/S值。测试条件：待测样品2次对折，D65光源，2°角，采样孔径为5 mm，波段为350～700 nm，每块样品取5点处测试，取其平均值。

1.6.2蚕丝丝素纤维Zeta电位值测试

采用机械方法将蚕丝丝素纤维磨成粉末，然后分别称取一定质量的纤维粉末，浸渍于不同pH值的水溶液中，磁力搅拌10 min，采用粒度及电位分析仪测试不同粉末样品的Zeta电位值。

1.6.3偶合修饰的吸附过程测定

采用残液吸光度法，测试不同反应时间后偶合修饰体系中邻硝基苯胺重氮盐在278 nm条件下的吸光度值，依据邻硝基苯胺重氮盐的标准曲线求不同时刻的浓度，并按照下式计算不同时刻邻硝基苯胺重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附量，绘制偶合修饰的吸附量-时间曲线[16]。

式中：Qt为t时刻邻硝基苯胺重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附量，mmol/g；c0为邻硝基苯重氮盐的初始浓度，mmol/L；ct为t时刻邻硝基苯重氮盐的浓度，mmol/L；V为反应溶液的体积,L；m为蚕丝丝素纤维的质量,g。

1.6.4吸附等温线的绘制

配制不同浓度的重氮盐反应液，然后将质量为1.00 g的蚕丝丝素纤维分别投入到上述各反应液中，控制偶合反应液pH值为6.8，反应浴比为1∶500，于5 ℃条件下进行偶合反应，待吸附平衡后，测定残液的吸光度值。根据标准曲线计算平衡时残液中的重氮盐组分质量浓度Ds，按下式计算平衡时各纤维上的重氮盐组分吸附量Df[17]。以Df对Ds作图绘制吸附等温线。

式中：C0为反应液的起始质量浓度，mg/L；Ceq为吸附平衡时反应液的质量浓度mg/L。

2 结果与讨论

2.1 修饰蚕丝丝素K/S值的影响因素

2.1.1碱预处理对K/S值的影响

测试了碱预处理和未处理的蚕丝丝素纤维在偶合修饰后的K/S值，结果如图2所示。

图2 蚕丝丝素纤维的K/S值曲线Fig.2 K/S value curves of silk fibroin fiber

由图可知，碱预处理工艺对蚕丝丝素纤维偶合修饰有较大的影响，在相同的偶合修饰工艺下，碱预处理蚕丝丝素纤维呈黄色，在350～500 nm波段具有较高的K/S值，且得色较深。修饰后蚕丝丝素蛋白分子与邻硝基苯胺重氮盐分子结构形成大共轭结构[13]，在可见光区产生特征吸收，吸收强度与参与反应的酪氨酸残基数量成正比，即蚕丝丝素蛋白中越多的酪氨酸残基参与修饰反应，则修饰后蚕丝丝素纤维得色越深，说明蚕丝丝素蛋白酪氨酸残基偶合修饰反应率越高。

综上，蚕丝丝素纤维经碱预处理后，酪氨酸残基参与偶合修饰的反应率增加。碱预处理后，蚕丝丝素蛋白酪氨酸残基结构的酚羟基会发生电离形成苯氧基负离子，使其电子云密度增加，从而促进了偶合修饰反应的发生[4]，推测碱预处理对蚕丝丝素蛋白酪氨酸残基电子云密度与偶合修饰反应的影响机制如图3所示。

注：代表蚕丝丝素蛋白大分子。

为对比碱预处理后蚕丝丝素纤维Zeta电位值的变化，同时测试了不同酸碱环境下蚕丝丝素纤维的Zeta电位值，结果如图4所示。

图4 不同pH值条件下蚕丝丝素纤维Zeta电位值Fig.4 Zeta potential values of silk fibroin fiber at different pH values

由图可知：蚕丝丝素纤维在强酸环境下带正电荷，此时丝素蛋白发生碱式电离，且纤维的Zeta电位值随pH值的升高而逐渐减小；蚕丝丝素纤维的等电点处于pH值为4～4.1之间，等电点后，再随pH值的升高，蚕丝丝素蛋白发生了酸式电离，且随pH值的升高，丝素纤维的Zeta电位值的绝对值逐渐升高，表明纤维表面的负电荷效应更加显著：因此，经碱预处理后，蚕丝丝素纤维表面带有较多负电荷，而未经碱预处理的蚕丝丝素纤维在偶合体系(pH值为6.8)下，纤维表面的负电荷量相对较少，且丝素蛋白或处于尚未电离状态，负电荷效应较低，对比之下，碱预处理后的蚕丝丝素纤维与重氮盐正离子之间发生偶合修饰反应的速率和效率将更高。

综上所述，蚕丝丝素纤维的碱预处理一方面增加了酪氨酸残基结构中酚羟基邻位碳的电子云密度，另一方面降低蚕丝丝素纤维的Zeta电位值，促使纤维带有更多的负电荷，二者将有利于丝素蛋白酪氨酸残基与重氮盐发生偶合修饰反应。

2.1.2重氮盐组分用量对K/S值的影响

依据邻硝基苯胺重氮盐与蚕丝丝素蛋白中酪氨酸成分的量比值，设定了8个反应梯度：1/6、1/4、1/2、2/3、1、1.5、2.3，并在5 ℃条件下反应30 min，浴比为1∶100，pH值为6。测试了在不同重氮盐组分用量条件下偶合蚕丝丝素纤维的K/S值，结果如图5所示。

图5 重氮盐用量对蚕丝丝素纤维K/S值的影响Fig.5 Effect of dosage of diazonium salt on K/S value of silk fibroin fiber

由图5可知，随着重氮组分用量的增加，修饰后蚕丝丝素纤维的K/S值逐渐升高，当n(重氮盐)∶n(酪氨酸)=2∶3时，修饰纤维的K/S值趋于稳定，再持续增加重氮组分用量，K/S值几乎没有提高，表明该用量下，蚕丝丝素蛋白中酪氨酸残基的偶合修饰反应已达到平衡。当n(重氮盐)∶n(酪氨酸)=2∶3时，丝素蛋白中酪氨酸残基参与的偶合修饰反应已达到平衡，原因与丝素蛋白的结构直接相关，丝素蛋白由结晶区和无定形区组成，酪氨酸成分在蛋白结晶区也有分布[6]，但仅丝素蛋白无定形区中的酪氨酸残基才有可能参与到与重氮盐的偶合修饰反应中，且酪氨酸残基参与修饰反应还可能与蛋白微结构及反应位阻有关[6]，具体影响仍有待进一步研究证明。

因酪氨酸残基与重氮盐之间的偶合修饰生成的是共价键连接，二者反应与物质的量比相关，在n(重氮盐)∶n(酪氨酸)=2∶3的基础上，再继续增加重氮盐用量已无必要，同时增加重氮盐用量不利于调节反应浴的pH值；重氮盐组分过量也将加重后续污水的处理难度。

2.1.3偶合反应的pH值对K/S值的影响

偶合修饰pH值对修饰蚕丝丝素纤维K/S值的影响规律如图6所示。

图6 偶合pH值对蚕丝丝素纤维K/S值的影响Fig.6 Effect of pH values of coupling reaction on K/S value of silk fibroin fiber

由图6可知：当偶合反应的pH值在蚕丝丝素纤维等电点以下时其K/S值较低；当pH值在3～6.8之间时，随着偶合pH值升高，蚕丝丝素纤维的K/S值也随之增大。这是因为邻硝基苯胺重氮盐在强酸性条件下，反应活性较低，随着pH值升高，其反应活性逐渐提升，因此重氮盐与蚕丝丝素蛋白酪氨酸残基发生偶合修饰反应的活性增强，同时有利于促进更多的酪氨酸残基参与偶合修饰反应，但是当pH值超过6.8，继续增大偶合反应的pH值时，蚕丝丝素纤维的K/S值不再增大反而降低，这是因为邻硝基苯胺重氮盐在较高的pH值条件下，重氮盐结构将由顺式逐渐向失去反应活性的反式结构转变[18]，削弱了重氮盐的偶合反应能力，造成偶合修饰蚕丝丝素纤维的K/S值降低。因此，本文实验选取偶合pH值为6.8为蚕丝丝素纤维获取最大K/S值的条件。

2.1.4修饰时间对K/S值的影响

偶合修饰反应时间对修饰蚕丝丝素纤维K/S值的影响规律如图7所示。

图7 偶合时间对蚕丝丝素纤维K/S值的影响Fig.7 Effect of coupling time on K/S value of silk fibroin fiber

由图可知：当偶合反应时间不超过45 min时，随着偶合反应时间的延长，蚕丝丝素纤维的K/S值逐渐升高，但增加速率较为缓慢；当偶合时间达到45 min时，蚕丝丝素纤维的K/S值最大，为20.47；随后再延长偶合时间，蚕丝丝素纤维的K/S值将不再增加反而降低。为确保可反应的酪氨酸残基全部参与修饰反应，本文实验选取偶合时间45 min为蚕丝丝素纤维获取最大K/S值的条件。

2.1.5其他工艺因素对K/S值的影响

偶合修饰自身是温和的反应体系，前期研究已证明提高偶合修饰温度将导致重氮盐分解变质，使其反应活性降低[19]，同时文献[4,6]表明低温下偶合反应可进一步提升修饰位点的专一性，减少酪氨酸残基偶合修饰反应中副反应的发生。为此，可认为进一步探讨提高偶合温度对蚕丝丝素蛋白酪氨酸残基偶合修饰的影响已经没有意义，因此，本文蚕丝丝素纤维的偶合修饰在5 ℃条件下进行。

2.2 酪氨酸残基偶合修饰的吸附过程

依据1.6.3节方法，测试了邻硝基苯胺重氮盐在蚕丝丝素纤维上吸附量-时间曲线，结果如图8所示。

图8 邻硝基苯胺重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附过程Fig.8 Adsorption process of o-nitroaniline diazonium salt on silk fibroin fiber

由图可知，重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附时间短，吸附效率高，说明重氮盐与蚕丝丝素纤维反应用时短，反应速率高；特别在该修饰反应的初期，吸附速率曲线具有较高的斜率。蚕丝丝素纤维的偶合修饰反应具有的高效率是由该修饰反应机制决定的，在偶合修饰条件下，碱预处理可促进丝素蛋白的酸式电离，纤维带有负电荷，纤维与重氮盐组分产生库伦引力，重氮组分与蚕丝丝素纤维具有较强的亲和力，蚕丝丝素纤维可在短时间内对重氮盐组分产生强烈吸附，此时不存在传统阴离子染料对蚕丝纤维染色过程中出现的双电子层阻碍纤维对染料离子吸附的问题；吸附到蚕丝丝素纤维表面的重氮组分可与酪氨酸残基中酚羟基的邻位发生亲电取代反应，碱预处理将使酚羟基发生电离形成苯氧基负离子，进一步增加酚羟基邻位富电子不饱和碳的电子云密度，使偶合修饰反应进一步加速。

由图8还可看出：在修饰反应初始阶段，重氮盐组分在蚕丝丝素纤维上强烈吸附并快速发生偶合反应；修饰反应20 min后，继续延长反应时间，重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附量增加缓慢，反应时间达到45 min时，反应接近平衡，吸附量增加不再明显。

2.3 酪氨酸残基偶合修饰的吸附等温线

依据1.6.4节方法，在0.03～0.18 mmol/L的浓度范围内，采用6个不同起始浓度的邻硝基苯胺重氮盐分别对蚕丝素纤维进行偶合修饰，测试了邻硝基苯胺重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附等温线，结果如图9所示。采用Origin9.0作图软件按照Langmuir型、Freundlich型2种吸附类型的公式进行拟合，拟合公式[20 ]分别为y=Qbx/(1+bx)，y=Qxb。其中：Q为重氮盐在蚕丝丝素纤维上的吸附饱和值；b为吸附平衡常数，与吸附位点的亲和力有关。

注：和分别为Langmuir型、Freundlich型2种拟合曲线的相关系数。

3 结 论

1) 碱预处理是影响蚕丝丝素蛋白酪氨酸残基与邻硝基苯胺重氮盐发生偶合修饰反应的重要因素；碱预处理可促使酪氨酸残基中酚羟基电离，增加酚羟基邻位碳的电子云密度，同时碱预处理降低了丝素蛋白的Zeta电位值，二者作用均有助于丝素蛋白对邻硝基苯胺重氮盐的吸附并与其发生偶合修饰反应。

2) 经单因素优化，经邻硝基苯胺重氮盐偶合修饰的蚕丝丝素纤维在n(重氮盐)∶n(酪氨酸)=2∶3，pH值为6.8，温度为5 ℃条件下反应45 min可获得较高的K/S值；

3) 丝素蛋白酪氨酸残基与邻硝基苯胺重氮盐的偶合修饰反应具有较高的反应速率，该修饰反应耗时短；分别采用Langmuir与Freundlich 模型反应的吸附等温线进行拟合对比，发现丝素蛋白的偶合修饰反应更符合Langmuir 模型。