周龄对非肥胖型糖尿病背景小鼠体外受精效果的影响

阎 涛，胡 萍，徐 晨，王 琪，史丹丹，赵 静，王宏宇

(南京大学-南京生物医药研究院，南京 211800)

非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠是Makino及其同事繁育出的一种小鼠品系[1-2]，在自身免疫性Ⅰ型糖尿病研究中具有重要作用。分析目前已有的实验结果，发现NOD背景小鼠体外受精效率低，每只雌鼠平均可用的二细胞数量少，而且有资料显示NOD背景小鼠在体外受精过程中存在发育迟缓的现象[3]，因此本课题组对现有的实验操作进行改进，通过对不同周龄鼠体外受精效率的比较以及增加一次二细胞期受精率的统计，发现10周龄的NOD背景雌鼠进行体外受精效率明显高于其他周龄鼠，这一发现对NOD背景小鼠体外受精操作具有重要的指导作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

体外受精实验：4周龄(15～18 g)，6周龄、8周龄、10周龄(20～25 g)的NOD背景雌鼠(数量见表1、表2)；3～6月龄(30～35 g)NOD背景雄鼠，每次实验2只共4只。胚胎移植生仔率统计：受体全部采用3月龄(体重为25～35 g)的ICR雌鼠，4周龄、8周龄、10周龄实验组分别移植55只、40只、30只，共125只。实验动物(SPF级)全部由南京大学-南京生物医药研究院提供[SCXK (苏) 2015-0001]。饲养于南京大学-南京生物医药研究院屏障环境动物房(SPF级)[SYXK (苏) 2015-0001]。所有实验动物的操作程序均在南京大学-南京生物医药研究院实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准下进行(AP号：NRCMM05)。所有实验动物操作均符合实验动物的福利伦理，并给予实验动物人道主义关怀，符合实验动物使用的3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

PMSG(孕马血清雌激素，宁波三生公司)；hCG(人绒毛膜促性腺激素，宁波三生公司)；M16培养液(Sigma公司)用来胚胎培养；HTF培养液用以精子获能和精卵结合[配制100 mL需要0.5938 g NaCl，0.0350 g KCl，0.0049 g MgSO4·7H2O，0.0054 g KH2PO4，0.0755 g CaCl2，0.210 g NaHCO3，0.050 g葡萄糖，0.34 mL乳酸钠，0.0037 g丙酮酸钠，0.0075 g青霉素，0.0050 g链霉素，0.40 g BSA，0.04 mL酚红(0.5%)]。解剖剪；显微镊子；Motic体式显微镜；热台(DB-B1，国华)。

1.3 实验方法

1.3.1 超排

下午5:30雌鼠经腹腔注射PMSG，4周龄雌鼠每只注射5 IU，6周龄雌鼠注射7.5 IU，8、10周龄雌鼠均注射10 IU，48 h后雌鼠经腹腔注射hCG，hCG注射剂量同PMSG。

1.3.2 精子获能

雄鼠脱颈处死，打开腹腔，取出睾丸，分离剪取附睾尾部，用1 mL注射器扎破附睾使精液溢出，将精子转移到预平衡过的HTF获能滴中获能1 h。

1.3.3 取卵

注射hCG 14 h后将雌鼠脱颈处死，分离取出输卵管，体视显微镜在覆盖矿物油的HTF受精滴中撕开膨大部，使卵团流出，将流出的卵团转移到受精滴中。

1.3.4 受精

用移液器吸取5～10 μL精子加入含有卵团的受精滴中受精培养，放入培养箱培养过夜。

1.3.5 统计受精率

24 h后统计一细胞、二细胞和异形胚胎数量，48 h后再统计一次。

1.3.6 移植生仔率

选取本单位日常生产项目中2016—2018年的NOD品系移植生仔数据进行比较，观察不同周龄NOD雌鼠获得胚胎后移植到ICR雌鼠受体中的生仔率。ICR受体为假孕0.5 d，移植方式为输卵管移植。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同周龄NOD雌鼠获得的体外受精二细胞胚胎数量

两次实验，分别统计了24 h和48 h后的实验结果，结果显示随着周龄增加每只小鼠获得的二细胞胚胎数呈递增趋势， 8周龄每只雌鼠获得二细胞胚胎数高于4周龄(P< 0.05)，但是略低于6周龄(P> 0.05)。受精后48 h与24 h相比，二细胞胚胎数量增多，具体数据见表1、表2。

2.2 2016—2018年的NOD品系移植生仔数据

不同周龄NOD雌鼠进行体外受精，将得到的胚胎进行移植，4周龄雌鼠获得的胚胎移植生仔率最低，8周龄雌鼠胚胎移植生仔率高于4周龄，10周龄最高。具体胚胎移植生仔数据见表3。

3 讨论

由实验数据可以看出NOD背景的小鼠，在4周龄到10周龄范围内随着雌鼠周龄的增大，每只小鼠获得的二细胞胚胎数量先增多，8周龄雌鼠出现降低，10周龄左右的雌鼠进行体外受精(IVF)效果最好。国内有研究使用4、8、16周雌鼠进行体外受精实验，发现8周龄雌鼠超排效果最差[4]。国外的类似研究也发现8周龄左右的雌鼠超排量会降低[5]。可能的原因是NOD雌鼠相比其他品系雌鼠性成熟周龄大，7～8周龄才性成熟，性成熟后生殖器官发育完全，对于超排激素的耐受性增强，由于机体抵抗外源物质的作用使得排卵量不如6周龄，但是8周龄雌鼠由于自身器官机能不如10周龄雌鼠，所以排卵量要低于10周龄雌鼠。

统计历史移植生仔数据，结果显示随着雌鼠周龄增加体外受精生产的胚胎移植生仔率升高。移植生仔率是一项波动较大的数据，后续还需要继续积累不同周龄雌鼠生产的胚胎移植生仔数据，以便通过大数据的积累，提供更为有力的证据。在利用显微注射方法生产转基因小鼠时也发现使用4周龄雌鼠进行体外受精实验产生的可用胚胎数量也要少于6～10周龄的雌鼠[6]。

受精后48 h再次统计数据的时候可用胚胎数量增加，但是该观察结果是否具有研究价值还需要进一步研究，因为48 h的数据相比于24 h增加的胚胎数量不明显，在实际生产中推广的意义也不大。对于实际生产，每只雌鼠可用的二细胞胚胎数量比受精率更有实际意义，所以本文中并未体现受精率的数据。目前并未进行48 h后转化为二细胞胚胎的移植实验，今后需要增加该种胚胎移植生仔效果实验，该实验还可以为是否有必要将胚胎培养至受精后48 h提供重要参考价值。

表1 第一次实验受精效果数据Table 1 In vitro fertilization results of the first experiment

注：4组组间比较：4周龄组和其他三组比较，P< 0.05；10周龄组和其他三组比较，P< 0.05；6周龄组和8周龄组相比，P> 0.05。表2同。

Note. Comparison among four groups: 4-week-old compared with the other three groups,P< 0.05; 10-week-old compared with the other three groups,P< 0.05; and 6-week-old group compared with the 8-week-old group,P> 0.05. The same as in Figure 2.

表2 第二次实验受精效果数据Table 2 In vitro fertilization results of the second experiment

表3 2016—2018年的NOD品系移植生仔数据Table 3 Pup birth rate of in vitro-fertilized embryos of NOD mice after transferred into ICR female mice as recipients during 2016-2018

目前针对NOD小鼠体外受精的文献较少，通过实验发现有些NOD背景小鼠的胚胎存在发育相对迟缓的情况，受精24 h后的观察结果与受精后48 h的观察结果不同，主要是一部分畸形的胚胎又转变为二细胞胚胎，这其中的机制有待于进一步研究。NOD背景小鼠受精卵的原核相对于C57BL/6J小鼠发育迟缓很多，有研究显示在体外受精实验结束后8 h进行显微注射大部分的受精卵无法发育到正常形态的二细胞胚胎，很多都处于形态异常状态，在体外受精15 h后注射后的胚胎才能发育到不存在形态异常的二细胞阶段[5]。这一研究成果还可以应用到通过显微注射方法生产转基因小鼠领域，为了获得更为高效的注射效果，在通过显微注射方法生产转基因小鼠的时候最好延迟注射时间。

目前广泛应用的小鼠品系如C57BL/6J进行超排的周龄一般为4周龄左右，但是NOD背景小鼠使用4周龄雌鼠进行超排后再进行体外受精实验的效果很差，受精率低，每只雌鼠可用二细胞胚胎数量明显低于平均水平。针对目前NOD背景小鼠可用二细胞胚胎数量低的情况，本实验进行了相关研究，并得到了有意义的结果，为今后实际生产提供了有效的指导，在降低生产成本的同时还保证了实验效率。结果证实10周龄NOD雌鼠进行体外受精效果最好。