GC-MS/MS法检测生物样品中硫丹含量

张 帆 ，乔君元 ，禹明筠 ，贾 娟 ，曹 洁 ，张 潮 ，崔海燕 ，贠克明 ，尉志文

（1.山西医科大学法医学院，山西 太原 030024；2.太原市公安局，山西 太原 030024）

硫丹（endosulfan）是一种非内吸性、广谱、高毒有机氯杀虫剂，有α硫丹和β硫丹两种同分异构体[1]。虽然硫丹已于2011年被《斯德哥尔摩公约》列入禁用物质列表，但在我国部分地区的农业生产中仍然经常使用[2]。因此，利用硫丹进行自杀、投毒或发生误食的案件仍时有发生[3-4]。由于硫丹对水生动物具有触杀的高毒作用[5-6]，因此常被不法分子用于毒杀鱼类等水生动物，造成严重的经济损失。目前对于硫丹的检测多见于农药残留检测[7-8]，牛奶、海鲜等食品出口检验检疫[9-10]以及环境土壤和水域的监测[11-12]等领域，对于生物样品中硫丹的检测主要有固相萃取-气相色谱/电子捕获检测器（SPE-GC/ECD）[9]、气相色谱/负化学离子源质谱（GC-NCI/MS）[13]、凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱（GPC-GC/MS）[10]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]等方法。但因法医毒物分析工作的特殊性，在实际工作中能够获取到的检材量通常较少，现有方法所采用的检测手段尚不能完全满足法医毒物分析实际工作的需要。因此，本研究拟建立一种生物检材中硫丹的检测方法，旨在为硫丹中毒相关案件法医学鉴定中毒物分析检材的采集和分析提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

7890B-7000C气相色谱-三重四级杆串联质谱仪、G4513A自动进样器（美国Agilent公司），ET3301全自动氮吹浓缩仪［欧陆科仪（远东）有限公司］，VORTEX-GENIE 2漩涡混合器（美国Scientific Industries公司），SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），Eppendorf Research®plus单道移液器（德国Eppendorf公司）。

α硫丹、β硫丹标准品购于北京世纪奥科生物技术有限公司，用甲醇配制成质量浓度为100μg/mL的储备溶液，置于4℃冰箱中避光保存。甲醇为色谱纯，二氯甲烷、乙腈、丙酮、乙酸乙酯均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 样品制备

精密量取待测血液样品1 mL置于15 mL具塞离心管中，加入去离子水1 mL，涡旋混匀30 s后再加入5 mL乙腈，涡旋振荡2 min，以离心半径11 cm，3 500 r/min，离心10 min后取出上清液。重复萃取1次。合并萃取液于氮气流下40℃水浴挥干，残渣用200 μL甲醇定容，过0.22 μm滤膜后置于样品瓶中，取1μL进行GC-MS/MS检测。

精密称取待测肌肉样品1g经研磨后置于15mL具塞离心管中，加入去离子水1mL，涡旋混匀30s后再加入5mL乙腈，涡旋振荡2min，以离心半径11cm，3 500 r/min，离心10 min后取出上清液。重复萃取1次。合并萃取液于氮气流下40℃水浴挥干，残渣用200 μL甲醇定容，过0.22 μm滤膜后置于样品瓶中，取1μL进行GC-MS/MS检测。

1.3 仪器方法

1.3.1 色谱条件

DB-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：氦气（纯度为 99.99%）；流速：1mL/min；程序升温：初始温度150℃，保持2min，以20℃/min升至280℃，保持 7min；分流进样；分流比：1∶10；进样量：1μL。

1.3.2 质谱条件

离子源：电子轰击电离源（EI）；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；接口温度：280℃。溶剂延迟3min，采用多反应监测（MRM）模式扫描，所选择的母离子、子离子及碰撞能量见表1。

表1 α硫丹和β硫丹的MRM离子对及所需的碰撞能量

1.4 方法学验证

本研究对所建立检测方法的选择性、线性、检出限、定量限、精密度、准确度和稳定性进行验证[15]，并应用于实际案例。

选择性：取10份不同来源的空白血液、肌肉，按照1.2节的方法进行样品制备，1.3节的方法进行仪器分析。要求空白基质中的物质对待测物的检测没有干扰。

线性：分别取空白血液1 mL和空白肌肉1 g各8份，血液中加入去离子水1 mL，肌肉研磨后加入去离子水1mL，添加相同体积不同质量浓度的α硫丹和β硫丹储备溶液后涡旋混匀，配制成0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL（μg/g）的血液或肌肉样品。按照1.2节的方法进行样品制备，按照1.3节的方法进行仪器分析。以α硫丹和β硫丹的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立线性回归方程。

检出限及定量限：分别取空白血液1 mL和空白肌肉1 g各6份，血液中加入去离子水1 mL，肌肉研磨后加入去离子水1 mL，添加相同体积不同质量浓度的α硫丹和β硫丹储备溶液后涡旋混匀，配制成1、2、4、8、16、32ng/mL（ng/g）的血液或肌肉样品。 按照1.2节的方法进行样品制备，按照1.3节的方法进行仪器分析。以信噪比（S/N）≥3时的样品最低浓度为检出限（limit of detection，LOD），以 S/N≥10 时的样品最低浓度为定量限（limit of quantitation，LOQ）。

精密度及准确度：分别取空白血液1mL和空白肌肉1g各54份，血液中加入去离子水1mL，肌肉研磨后加入去离子水1mL，添加相同体积不同质量浓度的α硫丹和β硫丹储备溶液后涡旋混匀，配制成0.25、2.5、10μg/mL（μg/g）的血液和肌肉样品各 18 份，每天取6份进行测定，连续测定3d。按1.2节的方法进行样品制备，按1.3节的方法进行仪器分析，得到日内、日间精密度［以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示］，并根据工作曲线计算准确度。精密度及准确度控制在15%以内可视为良好。

稳定性：对已处理样品中α硫丹和β硫丹在室温、4℃和-20℃避光条件下放置6～72h的稳定性，血液和肌肉样品中α硫丹和β硫丹反复冻融的稳定性，以及储备溶液在4℃避光条件下放置30d的稳定性进行考察。 分别考察 0.25、2.5、10μg/mL（μg/g） 3 个浓度，每个浓度采用6个平行样本。考察已处理样品在室温、4℃和-20℃避光条件下72 h内的稳定性和储备溶液在4℃避光条件下放置30d的稳定性时，需要将相应样品间隔一定时间进样，以目标分析物的绝对峰面积计算其含量变化。考察样品反复冻融的稳定性时，需要将样品置于-20℃冷冻21h，室温解冻3h，循环3次，以工作曲线法检测样品中目标分析物的含量变化。含量变化在20%以内可视为稳定。

2 结 果

2.1 提取溶剂选择

本研究比较了血液和肌肉样品中α硫丹和β硫丹经乙腈、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯的提取回收率。在两类样品的四种提取溶剂中，二氯甲烷提取的回收率均最低，乙腈的提取回收率均最高。故采用乙腈作为血液和肌肉样品沉淀蛋白的溶剂进行样品前处理。

2.2 方法学验证

2.2.1 选择性

α硫丹和β硫丹标准品的总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）见图1，空白血液中添加α硫丹和β硫丹的总离子流色谱图见图2，空白肌肉中添加α硫丹和β硫丹的总离子流色谱图见图3。经乙腈沉淀蛋白后采用GC-MS/MS同时检测α硫丹和β硫丹的方法，专属性强，特异性好，血液和肌肉中内源性物质对α硫丹和β硫丹的检测没有干扰。

图1 α硫丹和β硫丹标准品的总离子流色谱图

图2 血液中添加α硫丹和β硫丹的总离子流色谱图

图3 肌肉中添加α硫丹和β硫丹的总离子流色谱图

2.2.2 线性、检出限及定量限

血液样品中α硫丹和β硫丹在0.0625～10μg/mL范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.99；肌肉样品中α硫丹和β硫丹在0.0625～10μg/g范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.98。本方法的线性范围、检出限和定量限能够满足法医毒物分析实际检案的需要，详见表2～3。

2.2.3 准确度与精密度

血液样品中α硫丹和β硫丹的准确度为93.59%～106.17%，日内精密度为2.35%～6.65%，日间精密度为6.95%～9.74%；肌肉样品中α硫丹和β硫丹的准确度为90.76%～108.91%，日内精密度为5.32%～8.71%，日间精密度为5.44%～10.29%。本方法的准确度及日间、日内精密度均符合方法验证的要求，详见表4～5。

表2 血液样品中α硫丹和β硫丹的线性方程、相关系数、LOD和LOQ

表3 肌肉样品中α硫丹和β硫丹的线性方程、相关系数、LOD和LOQ

表4 血液样品中α硫丹和β硫丹的准确度及精密度

表5 肌肉样品中α硫丹和β硫丹的准确度及精密度

2.2.4 稳定性

已处理血液样品中α硫丹和β硫丹在室温避光条件下放置6h均稳定，含量变化范围为10.08%～13.71%；在4℃避光条件下放置12h均稳定，含量变化范围为8.05%～11.97%；在-20℃避光条件下放置72h均稳定，含量变化范围为6.38%～10.66%。已处理肌肉样品中α硫丹和β硫丹在室温和4℃避光条件下放置12 h均稳定，含量变化范围为6.83%～13.62%；在-20℃避光条件下放置72h均稳定，含量变化范围为10.08%～12.70%。血液样品中α硫丹和β硫丹经过反复冻融3次后均稳定，含量变化范围为4.50%～9.18%；肌肉样品中α硫丹和β硫丹经过反复冻融3次后均稳定，含量变化范围为2.94%～10.13%。储备溶液在4℃避光条件下放置30d均稳定，含量变化范围为10.33%～14.47%。

2.3 案例应用

某鱼塘发生大量鱼和螃蟹突然死亡的现象，造成重大经济损失。警方根据侦查情况初步怀疑系人为投毒所致。现场勘验人员取若干死亡的鱼和螃蟹以及鱼塘水、水面漂浮物送检，按本研究建立的方法进行检测，均检测到了硫丹。采用LSD-t检验发现（表6）：在鱼体内，α硫丹和β硫丹均在尾部含量最高，其次为腮部（P＜0.05）；在螃蟹体内，α硫丹和β硫丹均在腮部含量最高（P＜0.05）。结合现场勘验情况，本案确定以投毒案立案侦查。案件侦破后，确定系人为投放硫丹所致。

表6 α硫丹和β硫丹在鱼和螃蟹体内的分布及质量分数 （n=9，±s，μg/g）

表6 α硫丹和β硫丹在鱼和螃蟹体内的分布及质量分数 （n=9，±s，μg/g）

注：1）与同一物种腮部比较，P＜0.05；2）与同一物种尾部比较，P＜0.05；3）与同一物种头部比较，P＜0.05

化合物螃蟹头部 腮部 腹部 背部 尾部 躯干 蟹钳 腮部 蟹黄α 硫丹 7.41±2.351）2） 15.66±2.012） 6.29±1.651）2） 4.97±0.951）2） 26.19±2.551） 0.05±0.071） 0.10±0.111） 10.31±3.29 0.16±0.121）β 硫丹 7.12±1.741）2）12.88±0.882） 5.77±1.201）2） 4.15±1.271）2）3） 18.51±1.151） 0.01±0.021） 0.08±0.101） 7.39±2.41 0.07±0.061）鱼

3 讨 论

本研究对生物样品中硫丹的提取方法进行了筛选，大大减少了待检样品的使用量，采用乙腈作为提取溶剂，相对于其他学者采用的乙酸乙酯-乙腈混合提取[9]、丙酮-正己烷混合提取[13]、二氯甲烷[16]等提取溶剂，血液和肌肉中α硫丹和β硫丹均具有较高的回收率，能够满足微量生物检材中硫丹的定性定量分析要求，所建立的乙腈沉淀蛋白法提取血液和肌肉样品中硫丹，并用GC-MS/MS法进行检测，灵敏度高，操作简便，可在硫丹中毒案件的法医学鉴定中有效应用。

稳定性实验结果显示：已处理样品中α硫丹和β硫丹在室温和4℃避光保存条件下稳定时限较短，在-20℃避光保存条件下稳定时限较长。该研究结果提示，疑似硫丹中毒的生物样品提取后应尽快进样，或在-20℃避光条件下保存。反复冻融对生物样品中α硫丹和β硫丹的影响较小，但尚需对α硫丹和β硫丹在不同保存温度下生物样品中的长期稳定性进一步研究。

应用本研究所建立的方法对中毒案件中鱼和螃蟹体内不同部位的硫丹含量进行检测，结果显示：鱼体内α硫丹和β硫丹均在尾部肌肉中含量最高，其次为腮部；螃蟹体内α硫丹和β硫丹在腮部含量最高。究其原因可能是由于腮作为鱼和螃蟹等水生动物的呼吸器官，主要承担气体交换任务，流经腮部的水流量与血流量之比约为10∶1[17]，因此水中的硫丹有可能在腮部形成富集。硫丹在鱼尾部富集的原因，推测可能是由于鱼类主要依靠尾部摆动在水中游动，因此尾部血流量可能较其他部位略高。但是由于案件中获得的样本数量尚较少，对硫丹在水生动物体内不同部位的总体分布情况描述可能存在一定偏差，尚需大样本数据支撑。

本研究采用全扫描模式检测鱼蟹样品时，还发现两个丰度较高的物质，使用美国国家标准与技术局（National Institute of Standards and Technology，NIST）数据库推断系硫丹醚和硫丹二醇，可能为硫丹在体内的代谢物或生物标志物。有文献[1，18-19]报道，硫丹在环境介质中可被微生物分解为硫丹二醇、硫丹醚和硫丹硫酸盐等产物，在自然情况下经紫外光照射数天后主要转化为硫丹二醇及少量的硫丹醚。另有文献[20]报道，硫丹二醇和硫丹醚是硫丹农药乳液工业生产过程中的中间体和上游原料。因此，对于涉及硫丹中毒的案件，硫丹醚及硫丹二醇是否可以作为入体生物标志物尚需进一步研究。

综上所述，本研究所建立的生物样品中硫丹的GC-MS/MS检测方法快捷、准确、灵敏，适用于微量生物检材中硫丹的检测，且硫丹在水生动物体内分布不均，能够为硫丹相关案件法医学鉴定中毒物分析检材的采集和分析提供一定依据。