微型近红外光谱仪快速测定桔梗有效成分研究＊

张湘东，马晋芳，罗娟敏，葛发欢，肖 雪

（1.中山大学南沙研究院 广州 511458；2.中山大学药学院 广州 510006；3.江西中烟工业有限责任公司技术研发中心 南昌 330006；4.广东药科大学 广州 510006；5.广州中大南沙科技创新产业园有限公司 广州 511458）

R93近红外光谱具有无损、分析速度快、分析成本低、适用性广、可以同时检测多种样品或多种成分等优势，因此，近红外光谱快检技术作为一种新型的检测手段[1-2]，已经被越来越多地应用于饲料、食品、药品快检等行业。实际工作中，尤其是中药材质量评价中，需要根据《中国药典》对该药材进行质量评价，但操作繁琐，费时费力。近红外光谱快检技术的出现，可以在现场进行质量评价，因此弥补了中药材采收或收购现场质量把关的不足，节省了检测时间，提高了工作效率。随着这一需求的出现，相应的微型近红外光谱仪也在食品、药品、饲料行业盛行开来。

Micro NIR-1700微型近红外光谱仪[3-5]因为具有体积小，光源、滤光片、检测器集于一体等优势，可现场直接连接电脑进行采样和实际测量，为中药材质量评价提供了便利。中药桔梗是桔梗科植物桔梗Platycodon grondiflonm（Jacq.）A.DC.的干燥根，味苦、辛，性平，肺经[6]，是临床应用较多的一味中药，且药食同源，市场需求量大[7-8]。其中桔梗皂苷D是其主要活性成分[9]。

本研究采用Micro NIR-1700微型近红外光谱仪，以中药桔梗为例，使用THUNIR V3.0化学计量学分析系统，结合偏最小二乘法，建立桔梗皂苷D的定量校正模型，验证微型近红外光谱仪的实际应用的准确性和适应性。

1 材料和方法

1.1 仪器和药材

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；十万分之一分析天平（XS205 DuaLRange型，梅特勒-托利多）；Micro NIR-1700微型近红外光谱仪（美国JDSU公司）；化学计量学分析系统（THUNIR V3.0，清华大学）；桔梗皂苷D（纯度99.00%，购自于中国食品药品研究院）。乙腈（色谱级，购于德国默克公司），其它试剂均为分析纯。桔梗药材（市售，一共65个批次）。

图1 桔梗粉末原始近红外光谱图

表1 校正集样本中桔梗皂苷D的含量测定表

1.2 各样本真实值的测定[10-11]

1.2.1 色谱条件

Kromasil100-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（pH=3.0）（30∶70）为流动相，检测波长210 nm，流速为0.7 ml/min，柱温35℃，进样量20 μL。

1.2.2 溶液的制备

精密称取桔梗皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

精密称取5 g桔梗粉末，至于50 mL锥形瓶中，加入25 mL甲醇，超声提取30 min，过滤，取滤液，旋转蒸发器回收甲醇，收集提取物，向其中加入20 mL水，再加入30 mL乙醚脱脂，收集水溶液，用水饱和正丁醇提取，提取液浓缩至干，加甲醇溶解定容至10 mL。

1.2.3 真实值的测定

按照色谱条件，经HPLC测定，得各样本的真实值。

1.3 各样本近红外光谱的测定

取65批的桔梗样品，采用近红外光谱仪进行近红外光谱数据的采集，按如下条件扫描：漫反射模式，分辨率2 nm，扫描次数32次，波长扫描范围900～1 700 nm。每丸重复扫描3次，得出平均的准确的光谱数据保存为txt格式，并转换为CVS格式。采集的原始近红外光谱见图1。

1.4 模型的建立

采用THUNIR软件[12-13]，对采集的近红外光谱数据进行多种光谱预处理方法的比较，同时，根据HPLC测定的质控指标成分的含量真实值，选择具有特征的波段，结合偏最小二乘法（partial least squares，PLS）建立桔梗皂苷D的定量校正模型，采用留一法进行内部交叉验证，确定模型的主因子数，对未知的桔梗样本进行桔梗皂苷D的含量预测，并与真实值进行比较。采用交叉验证标准误差（SECV）、相关系数（R2）对模型的优劣进行评价。

2 结果与分析

2.1 指标性成分真实值测定的方法学考察

采用HPLC法测定桔梗中桔梗皂苷D，采用外标法进行计算，绘制了桔梗皂苷D的标准曲线，得到回归方程Y=130.3848X-64.4824。方法学考察中，精密度试验的RSD值为1.35%、重复性试验的RSD值为3.78%、稳定性试验的RSD值为2.57%，均低于3%。加样回收率试验采用加入100%浓度的六份样品进行测定，回收率在98%～105%之间，RSD低于3%。实验结果表明，方法学考察均符合要求，可见该HPLC测定方法的精度高、重复性好、稳定性好、回收率高。

2.2 近红外校正集样本和验证集样本的选择及划分

根据HPLC测定结果，将测定的65个桔梗样本分为校准集（52个）和预测集（13个）。如表1所示，并对校正集或预测值的桔梗皂苷D的含量进行比较，校准集的含量范围更大，且含量数据分布均匀，符合建模条件。

2.3 桔梗皂苷D定量校正模型的建立

2.3.1 异常样本的剔除

近红外光谱在采集过程中，会由于仪器或其他实验误差，可能导致采集的光谱存在异常，影响到模型的预测精度。THUNIR软件本身自带的离群样品判定方法可以进行异常样本的判定和剔除，本实验应用马氏距离阈值判定方法进行分析，将52个桔梗样本按照马氏距离排序，所有样本的马氏距离平均值为0.1346，阈值为0.2604，显示无异常样本超过阈值，证明52个样本均可以用来进行模型的建立，具体如下表所示。

表2 验证集样本中桔梗皂苷D的含量测定表

表3 离群样品判定原始数据

图2 桔梗皂苷D的近红外光谱预处理方法比较

2.3.2 近红外光谱的预处理

根据近红外光谱的特征，结合采集光谱的过程中，由于环境温湿度和粉末本身的均匀度等因素对光谱产生的影响，本研究中对桔梗的原始光谱和预处理光谱进行比较，进而提高信噪比和模型的预测精度，预处理方法见图2。由于近红外光谱主要反映-CH、-NH、-OH、-SH等官能团信息，因此，对常用的光谱预处理方法有卷积平滑、导数处理、多元散射校正、标准正态变量变换等等进行比较分析，结果显示一阶卷积求导的光谱预处理方法最有利于模型的建立，如表4所示。

2.4 近红外光谱的波段选择

近红外光谱中，存在有效信息的同时，还包含有噪音等干扰信息，导致建模的工作量增加，影响模型的精度，因此，在建模时，需要优选出最佳建模波段。本研究中，采用化学计量学软件提供的光谱区间选择功能，进行不同的波长选择方法的比较，比如有：相关系数法选择波长区间、全波长法选择波长区间、迭代优化波长选择方法等等方法，优选出最佳波段为1 050～1 614 nm，此波段建模SECV值更小，R值更大，所建模型的效果更好，如表5所示。

2.5 模型主因子数的确定

采用PLS方法建立定量分析模型时，主因子数是优化模型的关键步骤，主因子数的选择反映的是未知样本被测组分产生的光谱变化，直接影响到模型的实际预测能力。根据参考文献报道[12]，本实验采取内部交叉验证方法，考察不同主因子数对SECV的影响，优选出最佳的主因子数，结果表明，随着主因子数增加，SECV陡然下降，因此，选择主因子数为8，具体见图3所示。

表4 光谱预处理方法的模型参数比较

表5 波长选择方法的模型参数比较

2.6 建立最佳定量校正模型

本研究运用THUNIR V3.0化学计量学分析系统，根据表1中桔梗皂苷D的含量测定结果，建立定量分析模型，52份样品用于建模，选用一阶卷积求导对原始光谱进行预处理，最佳波段为1 050～1 614 nm，最佳主成分数是8，得到的定量校正分析模型的R2为0.9563，SECV值为0.0168，SEC值为0.0117，其他相关参数见图4。

图3 桔梗皂苷D的最佳主因子数选择

图4 桔梗皂苷D校正模型的相关参数

图5 桔梗皂苷D的预测值与真实值拟合图

2.7 定量校正模型的验证

采用建立的桔梗皂苷D定量校正模型，分别对剩余的13个验证集样本进行含量预测，如图5，结果显示桔梗皂苷D的真实值与预测值高度匹配，其预测的相关系数R2均≥0.90，表明桔梗皂苷D的模型具有较好的预测能力。

3 讨论

本研究采用Micro NIR-1700微型近红外光谱仪，采集桔梗药材的近红外光谱，并建立了桔梗皂苷D含量的近红外定量校正模型。结果显示该光谱仪的分析精度准确，能够满足实际快检应用中的需要。但与生产线中的近红外设备一样，属于一种间接的分析技术，其预测的准确性是建立在大量具有代表性样本准确测定的前提下。但其建立的过程中，需要耗费一定的人力进行样本的筛选，且花费大量的时间和精力。

微型近红外光谱仪在现代中药中的推广使用，可以为采购药材时的提供一种随时检测分析的新方法，使近红外光谱实现真正的便民服务。