包装饮用水生产工艺中微生物风险分析

陈玲，杨小鹃，陆永成，尚建钢，罗之纲，郭伟鹏，吴清平，张菊梅

(1.华南应用微生物国家重点实验室,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东省微生物分析检测中心,广东省微生物研究所，广东广州 510070）(2.上海康识食品科技有限公司，上海 201100）

微生物污染是引起食源性疾病的主要因素，长期以来，水传播病原微生物污染一直是饮水安全的最大威胁，历史上由水为媒介的传染病霍乱、伤寒、脊髓灰质炎、病毒性肝炎和寄生虫病等曾夺去千百万人的生命。尽管现代水消毒处理技术在一定程度上能够控制饮水微生物污染，但微生物仍然是水质控制的首要问题。包装饮用水的微生物污染问题是长期困扰生产企业食品安全的质量技术难题，同时也是每年各省市食品安全监管部门重点监督抽查的食品安全指标。世界卫生组织制定的《饮用水水质准则》第3版中明确提出，无论在发展中国家还是发达国家，与饮用水有关的安全问题大多来自微生物。当前，饮用水安全在世界各国都被摆在首位，随着人们关注度的提高，相应的检测标准也在不断更新。2006年我国制定的生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）中，与GB 5749-1985版相比，水质指标由35项增至106项，微生物指标由2项增至6项，新国标符合国际饮用水标准的发展趋势。随着经济的高速发展和消费者饮水习惯的改变，人们对包装饮用水的需求量日益增长，对水质要求也越来越高，这就要求企业生产过程中的各个环节必须保障饮用水安全，运用多重屏障如臭氧、紫外线（UV）照射、反渗透（RO）、过滤及蒸馏等来保障产品微生物安全[1]。目前，国内对于包装饮用水生产过程中出现的微生物（包括食源性致病菌），缺乏系统的调查分析和风险识别，本文以分布在A、B、C、D四个市的包装饮用工厂生产工艺中各环节的水为研究对象，对原水、过程水（指超滤水或砂滤水、碳滤水、UV水、RO水）和成品水进行微生物检测，监测项目包括菌落总数、霉菌和酵母计数、大肠菌群计数，以及铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌。同时利用传统和分子鉴定技术，对分离到的优势菌进行分类鉴定，以掌握背景资料，形成企业微生物分布图谱，为产品中污染微生物的溯源和工厂生产过程中微生物质量控制提供重要的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

图1 包装饮用水生产工艺及采样点Fig.1 Production process and samples layout plans in packaged drinking water company

根据GB/T 5750.2-2006《生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存》进行采样。采集分布在A、B、C、D四个市的包装饮用工厂内的原水、过程水（指超滤水或砂滤水、碳滤水、UV水、RO水）、成品水共33份样品。工厂生产工艺及采样点见图1，该包装饮用水企业的原水为市政水，对其进行多级净化处理，最终获得成品水。

1.1.2 主要试剂与仪器

微生物培养所用的培养基均由广东环凯微生物科技有限公司生产，API生化鉴定试剂条及其配套试剂购自法国生物梅里埃公司，BIOLOG生化鉴定相关试剂购自美国BIOLOG公司。细菌基因组提取试剂盒及PCR扩增试剂购自广州东盛生物科技有限公司，真菌基因组提取试剂盒购自美国Omega公司，PCR引物由北京六合华大基因科技有限公司广州分公司合成。

灭菌锅、生化培养箱、PCR仪、恒温水浴锅、超净工作台、生物安全柜。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

菌落总数参照GB/T 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》，霉菌和酵母计数参照 GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，大肠菌群计数参照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》，铜绿假单胞菌、粪链球菌和产气荚膜梭菌参照GB 8538-2016《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》。

1.2.2 菌种鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册》[2]和《常见细菌系统鉴定手册》[3]，分离的优势菌采用 API、BIOLOG生化鉴定系统和PCR方法扩增细菌16SrRNA基因进行菌种鉴定，其中分子方法具体操作步骤：

1.2.2.1 基因组DNA提取

选取样品培养所得微生物菌落中的优势菌株分离纯化后，根据相应基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取。

1.2.2.2 细菌鉴定方法

采用PCR方法扩增目标菌株的16S rRNA基因，引物：F27 (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')，R1492 (5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3')；PCR 扩增条件：94 ℃预变性，5 min；94 ℃变性，1 min；56 ℃退火，1 min；72 ℃延伸，2 min；共进行30循环；最后72 ℃终延伸，7 min。

1.2.2.3 测序与分析

扩增产物交付北京六合华大基因科技有限公司广州分公司进行测序分析。最后将所得测序结果提交到GENBANK(http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)进行比对，分析其与数据库中序列的相似性。

2 结果与讨论

2.1 生产工艺中微生物检测结果

共采集33份样品（A市10份，B市9份，C市和D市各7份），进行菌落总数、霉菌和酵母计数、大肠菌群计数，以及铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌的检测。所有样品霉菌和酵母计数、大肠菌群检出值均＜1 CFU/mL；砂滤水、碳滤水的菌落总数检出值较高，次之为UV水。33份样品中除了B市的RO水检出铜绿假单胞菌（检出值为6 CFU/250 mL）、A市的碳滤水检出粪链球菌（检出值为 10 CFU/250 mL）；其他样品铜绿假单胞菌和粪链球菌检出值均为0 CFU/250 mL、产气荚膜梭菌检出值均为0 CFU/50 mL。过程水（指超滤水或砂滤水、碳滤水、UV水、RO水）具体检测结果见表1，铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌的检测结果见表2。

由结果可知，四个工厂原水、超滤水以及成品水的微生物总体风险较低，其中经过臭氧工艺后的成品水所检测的微生物指标均未检出。而碳滤水菌落总数检出值较高，水体作为营养物质、颗粒物和微生物的载体，在其流动的过程中，微生物利用水体中的有机物进行生长繁殖，最终粘附在管壁上，随着时间推移，有可能形成生物膜。活性炭是种多孔性含炭物质，由于它具有发达的孔隙结构和巨大的比表面积，故能有效去除水中有机污染物，同时为微生物的栖息提供了场所[4]。越来越多研究表明，活性炭出水中微生物的数量会增加，主要是由于活性炭床上附着大量微生物，这些微生物从炭床脱落进入出水，从而使得活性炭出水中的微生物普遍高于其他单元出水的微生物。活性炭出水的细菌常与细小的活性炭颗粒一并流出，受炭粒的保护，该类细菌对不良环境有较强的适应性[5]。各种微生物可认为是以颗粒状态存在，建议工厂采用在线的颗粒计数仪定量检测出水中的颗粒物，通过控制各类颗粒的数量，保障水的微生物安全性。除此以外，应适当增加对活性炭的清洗消毒频率，定期更换活性炭，以免因吸附饱和失去功效。相比碳滤水检测结果，UV水菌落总数检出值略低，但其带来的微生物风险，会对后续水处理工艺中RO膜增加负荷，降低使用寿命，应引起关注。而在水处理工艺的末端添加了微滤（孔径≤1 μm）可去除细菌等颗粒污染物，降低了水体进入灌装区的微生物风险。

表1 过程水检测结果Table 1 Microbiological detection of supply-water

RO水AS7 7 ＜1 ＜1 BS7 ＜1 ＜1 ＜1 CS7 ＜1 ＜1 ＜1 DS7 ＜1 ＜1 ＜1

表2 致病菌检测结果Table 2 Microbiological detection of pathogenic bacteria

2.2 菌种鉴定

从四个工厂分离出34株菌株进行鉴定，均鉴定为细菌，未分离到真菌，结果见表3。分离的34株细菌中，共包括3个门，16个属，21个种，4株未鉴定到种，优势种群为食酸菌属（主要分离自碳滤水和 UV水）、假单胞菌属、芽胞杆菌属和分枝杆菌属（主要分离自超滤水和UV水）。从属的水平分析，分离的细菌主要由食酸菌属（18.2%）、假单胞菌属（12.1%）、分枝杆菌属（12.1%）、芽胞杆菌属（9.1%），其他占一小部分。分离的34株细菌中条件致病细菌有：乙酸钙不动杆菌（分离自砂滤水）、偶发分枝杆菌（分离自RO水和超滤水）、铜绿假单胞菌（分离自RO水）、粪链球菌（分离自碳滤水），其中不动杆菌属是非发酵条件致病菌，当机体抵抗力降低时可引起各种感染如脑膜炎、心内膜炎及败血症等[6]，偶发分枝杆菌属是革兰氏阳性杆菌，细胞壁含有分枝菌酸，为胞内寄生菌，能引起长期慢性感染，其中偶发分枝杆菌具有较强的适应力、容易引起伤口反复腐烂[7]。B市工厂的RO水中检出铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，该菌的生长对营养要求不高，对紫外线、消毒剂、干燥等物理因素及不良环境有较强的抵抗力，不易被杀死[8,9]；它能产生抗药性，增加感染患者的死亡风险，作为条件致病菌，可能引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症等疾病[10]。本研究团队魏磊等[11]对全国36家水厂的108份样本进行该菌的检测，结果显示全国山泉水水源水、活性碳过滤后水污染率较高，分别为66.7%、83.3%。除了铜绿假单胞菌，粪链球菌在水中的检出率也很高，Wei L等[12]在314份水中有48份样品检出粪链球菌，其中碳滤后水的粪链球菌污染率最高，为34.5%。本文A市工厂的碳滤水同样检出粪链球菌，对于如何监控分析此类条件致病菌污染原因并进行有效控制已成为包装饮用水生产厂家密切关注的问题。

表3 菌种鉴定结果Table 3 Identification of the predominant strains

注：a为未查到中文种名；b为未鉴定到种。

3 结论

包装饮用水企业四个工厂生产工艺对微生物的控制较为有效，微生物危害风险较低。在我国，包装饮用水微生物污染存在企业生产的各个环节，从源头难以有效控制；且微生物种类多易发生变异，使得污染控制技术需不停的调整和优化，以获得一套有效的车间质量监测体系。包装饮用水企业可参照 GB 19304-2018《食品安全国家标准 包装饮用水生产卫生规范》的相关要求，以及该标准附录A“包装饮用水加工过程的微生物监控程序指南”，进行固定频率的监控，各监控点的监控结果应当符合监控指标的限值并保持稳定，当发现严重不符合时，应立即纠正，同时查找问题原因。除此以外，建议包装饮用水企业开展常态化的微生物监控，除了对包装饮用水生产工艺的各个环节的水进行监控外，还应对环境、人员、设备和产品包装材料等进行微生物污染调查和风险识别研究，以获取完整的微生物风险评估数据；对于重要致病菌的监控，企业可根据条件引入PCR或环介导等温扩增(LAMP)等快速检测方法。管控产品发生微生物污染的风险，建立包装饮用水微生物安全风险和溯源数据库，依据现有规程及时纠正，从而建立新型包装饮用水的质量控制体系，提升整个行业风险控制能力，保证产品安全。