羊结肠小袋纤毛虫病的诊断与防治

2018-10-15 10:21宋开放崔琳琳翟焕杰邵立圣杨树宇姜金庆刘俊伟
中国兽医杂志 2018年6期
关键词:纤毛虫小袋包囊

周 叶,宋开放,崔琳琳,翟焕杰,邵立圣,杨树宇,姜金庆,刘俊伟

(河南科技学院动物科技学院,河南新乡453003)

羊结肠小袋纤毛虫病是由纤毛虫纲、毛口目、小袋虫科、小袋虫属的结肠小袋纤毛虫寄生于羊的大肠内所引起的以腹泻、脱水、消瘦和贫血为特征的人兽共患原虫病。引起羊腹泻的疾病,临床常见的有球虫病、鞭虫病、羔羊痢疾、大肠杆菌病、沙门菌病、食道口线虫病、夏伯特线虫病、食盐中毒、隐孢子虫病、副结核病等[1-2],但关于羊结肠小袋纤毛虫病引起的腹泻尚未见报道。笔者在兽医临床诊疗过程中,通过对疑似羊结肠小袋纤毛虫病的病羊进行临床检查,粪便实验室检验,粪便水洗沉淀物染色镜检,药物敏感性试验,诊断为羊结肠小袋纤毛虫病,并用甲硝唑、中药驱虫净散等进行了防治试验,有效控制了该病,报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 试验羊来自新乡市某杜泊绵羊养殖户,饲养规模100只,放牧散养,其中30只患严重腹泻疾病。

1.2 试剂与药品 可溶性淀粉培养基、蒸馏水、生理盐水、二甲苯、0.4%氢氧化钠溶液、2%碘液、美蓝染色液、甲醇、2.5%戊二醛、福尔马林、甲硝唑片等,由河南科技学院临床兽医学教研室提供;中药驱虫净散的原材料,购自新乡市医药公司,并按文献3的方法进行制备。

1.3 临床检查 采用问诊、视诊等临床基本检查方法对发病羊群进行检查,调查羊场的病史和临床发病症状。

1.4 粪便采集 采集粪便时,术者依次戴上医用乳胶手套和PVC手套,直接用手指从直肠内掏取粪便,再将PVC手套翻转脱下,羊粪即被包含其中,也可将采集到的羊粪放入洁净塑料袋中,编号登记后备用。如不能及时送检,可称取粪便10 g,加入90 mL 2.5%戊二醛或5%~10%福尔马林中固定后送检。

1.5 粪便直接压片法检查 取一片洁净的载玻片,在玻片中央滴加1~2滴生理盐水(冬季需加温),然后用镊子挑取少量粪便,与蒸馏水混匀,并将粗粪渣推向一边,涂布均匀,作成涂片,涂片的厚薄以放到书上隐约可见下面的字迹为宜,加上盖玻片,置显微镜下检查。粪便采集后应注意保温,并及时送检,冬季可放置28 ℃培养后再进行观察,防止羊结肠小袋纤毛虫滋养体运动性丧失或胞膜破裂。

1.6 粪便水洗沉淀物染色镜检 取4个1.5 mL离心管,加入羊结肠粪便混悬液各1 mL,1 500 r/min离心2 min,弃去上清液,分别加入美蓝染色液,2%碘液,苏木素染色液,瑞氏染色液各1 mL,震荡混匀,置室温染色,定期观察染色效果,染色完毕,1 500 r/min离心2 min,弃去染色液,用蒸馏水离心洗涤3次,终止染色,必要时用1%盐酸乙醇或蒸馏水分化,再用60%、70%、80%、90%、100%乙醇(2%碘液组脱水后,还需经2%碘无水乙醇复染),逐级脱水,每级脱水15 min,之后离心弃去上清液,沉淀加入二甲苯1 mL,震荡混匀,透明30 min,离心后,用加样器吸取0.7 mL二甲苯,震荡混匀,吸取悬液10 μL,均匀涂于载玻片中部,待二甲苯将干未干之际滴1滴中性胶,用眼科镊子夹一洗净擦干的盖玻片,使盖玻片一端衔接处中性胶后轻轻放下,中性胶即平铺于盖玻片之下,之后玻片于60 ℃干燥箱中烘干,置显微镜下观察。

1.7 药物敏感性试验 首先用可溶性淀粉培养结肠纤毛虫:复方氯化钠注射液500 mL,无菌操作加入标准胎牛血清25 mL,震荡混匀,置用4 ℃冰箱备用,用时每8 mL加入灭菌可溶性淀粉一铂耳,进行前述粪便中结肠小袋纤毛虫人工培养[4]。

然后,在96孔细胞培养板加入可溶性淀粉培养基50 μL/孔,至第12孔;每孔分别加入羊结肠小袋纤毛虫悬液50 μL,轻轻震荡细胞培养板,使各孔混匀,置28 ℃培养12 h,置倒置显微镜下观察羊结肠小袋纤毛虫滋养体的存活情况。将丙硫苯咪唑,盐酸左旋咪唑,甲硝唑,痢特灵,乳酶生,土霉素片,复方新诺明,血虫净、氨苄青霉素钠和中药驱虫净散制备成100 mg/mL混悬液或溶液,在前述细胞培养板中分别加入倍比稀释的药品溶液100 μL,观察小袋纤毛虫滋养体的存活情况。

1.8 药物防治试验 将羊场患严重腹泻的30只羊,根据发病情况平均划分为甲、乙两组,每组15只。甲组病羊用甲硝唑10 mg/kg体重,经口灌服,2次/d,连用3 d。乙组病羊用中药驱虫净散治疗,体重在50 kg以上的羊投50 g/次,体重在50 kg以下的羊25 g/次,开水冲,候温一次灌服,1次/d,连用7 d。同时,重症病羊配合补液,补糖,补充钙、磷和氨基酸,配合抗菌、止泻、解毒、强心、健胃等对症治疗措施。

2 结果与分析

2.1 临床检查结果 笔者走访发现,该绵羊养殖户采用圈养结合放牧的饲养方式,放牧时采食路边、河边的杂草和落叶,补饲花生秧、玉米、豆腐渣等饲料,圈舍是靠墙搭建的水泥瓦棚,粪尿清理不及时,有刺鼻氨气味,户主曾使用伊维菌素驱虫。本次共30只羊发病,发病率为30%,典型症状与其他动物结肠小袋纤毛虫病一致[5-7]。严重者多见于3~4月龄羔羊,可见病羊精神沉郁,体温39.5 ℃~40.5 ℃,食欲减退或废绝,饮欲增加,眼球下陷,皮肤弹性下降,起初排出软粪,很快变为糊状稀粪,甚至呈水样,带有黏液,气味腥臭,后躯及尾部被稀粪污染。慢性病例多见于产后母羊,病羊精神不振,四肢无力,喜欢卧地,食欲减退,异嗜,食欲废绝,体温正常或低下,病羊日渐消瘦,皮下脂肪减少,绵羊尾脂急剧减少,被毛粗乱,黏膜淡白或苍白,粪便含水量增加,排团状或条状软粪,呈粒状、团状或泥状。

2.2 粪便直接压片法镜检结果 病羊新鲜粪便直接压片镜检时,由于滋养体不断运动,观察和拍摄相对困难,可在虫体运动缓慢时用快门进行连续拍摄,结果见图1。羊结肠小袋纤毛虫滋养体呈梨形、纺锤形、卵圆形或圆形,灰黄或灰黑色,前端稍尖,中部最宽,后端稍圆。滋养体全身密生纤毛,纤毛摆动时呈规律的波浪状,使滋养体迅速前进,旋转。伸缩泡无色透明,有前、后两个,后方的一般较大,病羊粪便越稀,滋养体数目越多,运动越活泼,后伸缩泡也越大,甚至可达滋养体的二分之一[8]。

图1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体,粪便直接压片 (400×)

2.3 粪便水洗沉淀物染色结果 粪便沉淀物水洗后,可见为数众多的结肠小袋纤毛虫包囊。包囊为休眠期虫体,呈球形或卵圆形,灰黄或淡绿色,无纤毛,不运动,有2层囊膜,外膜较内膜稍厚,有时还可见到处于脱水浓缩期的包囊,其染色结果见中插彩版图2~5。羊结肠小袋纤毛虫包囊美蓝染色30 min,囊膜不着色,呈红色,在囊膜外残留的滋养体期的外膜呈淡蓝色,外质淡蓝色,内质深蓝色,食物泡和伸缩泡呈淡蓝色,胞核呈深蓝色(中插彩版图2)。羊结肠小袋纤毛虫包囊2%碘液染色30 min,胞膜不着色,呈红色,内质深黄色,外质、伸缩泡和胞核呈土黄色(中插彩版图3)。羊结肠小袋纤毛虫包囊瑞氏染色24 h,囊膜外层淡蓝色,内层为淡红色,外质淡红色,内质、食物泡和胞核呈紫红色(中插彩版图4)。羊结肠小袋纤毛虫包囊苏木素染色12 h,胞浆呈黄色,胞核淡红色;染色24 h,胞浆粉红色,食物泡和胞核呈深紫红色(中插彩版图5)。包囊的染色时间远远多于滋养体,说明包囊膜结构致密,通透性差,不易着染,而滋养体由于有胞口和胞肛的存在,通透性强,易于染色。

2.4 药物敏感性试验结果 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对药物的敏感性试验结果见表1。

表1 羊结肠小袋纤毛虫滋养体对药物的敏感性试验结果

判定标准:无羊结肠小袋纤毛虫滋养体存活的孔标记为(-),有羊结肠小袋纤毛虫滋养体存活的孔标记为(+)

本药敏试验中,血虫净、土霉素片、盐酸左旋咪唑、复方新诺明、痢特灵和氨苄青霉素钠对羊结肠小袋纤毛虫滋养体的绝对致死浓度LC100分别为:0.195 mg/mL、0.391 mg/mL、3.125 mg/mL、12.5 mg/mL、50 mg/mL和50 mg/mL,丙硫苯咪唑和乳酶生在浓度小于50 mg/mL时对羊结肠小袋纤毛虫滋养体无效,甲硝唑和中药驱虫净散在浓度低至0.025 mg/mL时,仍然杀灭了全部的结肠小袋纤毛虫。本试验显示,药物治疗结肠小袋纤毛虫病时,甲硝唑治疗效果优于血虫净,这与刘翠等人的研究结果一致[9]。

2.5 药物防治试验结果 甲组病羊治疗后第7天,除1只母羊仍有轻微腹泻症状,1只4月龄羔羊死亡外,其余均无明显症状,粪便饱和硫酸锌漂浮法发现还有3只羊呈现阳性,粪便转阴率为73.33%(11/15),继续治疗6 d后,全部康复,治愈率为93.33%(14/15)。乙组病羊治疗后第10天,有2只母羊仍有轻微腹泻症状,其余均痊愈,且末出现死亡病例,粪便饱和硫酸锌漂浮法发现还有3只羊呈现阳性,粪便转阴率为80%(12/15),继续治疗6 d后,全部康复,治愈率为100%(15/15)。结果可以看出,用甲硝唑和中药驱虫净散治疗羊结肠小袋纤毛虫病,均取得显著疗效,但治疗时一定要保证药物的剂量和疗程,确保粪便中羊结肠小袋纤毛虫全部被杀死,防止疾病反复。

3 讨论

3.1 粪便中羊结肠小袋纤毛虫的分离、固定与染色 粪便中含有纤维素、细菌、蛋白质、沙粒等异物,会影响羊结肠小袋纤毛虫的制片和观察的效果。新鲜粪便经直接涂片发现羊结肠小袋纤毛虫后,可采用生理盐水1 500 r/min离心水洗3~5次,再用2.5%戊二醛固定,可以洗掉虫体表面和纤毛上吸附的蛋白质等异物。离心管中进行染色、脱水后制片观察,可以避免染色和脱水时,虫体(特别是包囊)易脱落的现象。如染色过深,常规的做法是用1%盐酸乙醇脱色,其脱色的时间很短,很难操作和控制,特别是在离心管中染色时更难,另外,脱色后虫体颜色发灰发暗,很难染出色泽艳丽、层次分明的标本,如采用反复水洗脱色,可达到理想的染色效果。

3.2 药物对结肠小袋纤毛虫滋养体的杀灭试验 本试验建立了羊结肠小袋纤毛虫滋养体的药物敏感性试验方法,该方法将药液在平底96孔细胞培养板上进行倍比稀释,与等量的结肠小袋纤毛虫滋养体培养悬液混合,28 ℃作用12 h,在倒置显微镜下观察结果,测定药物的致死浓度(LC100),该方法简便、快捷、直观和实用。临床上也可以直接将新鲜粪便加液体培养基搅匀,粪网筛过滤,必要时进行离心浓集,制成滋养体悬液进行试验,以选出兽医临床防治的有效药物。

试验结果显示, 甲硝唑具有较好的抗羊结肠小袋纤毛虫滋养体活性效果,可用作临床的首选治疗药物,其次是血虫净和土霉素,这与抗猪结肠小袋纤毛虫滋养体的试验结果一致[9-10]。中药驱虫净散对结肠小袋纤毛虫滋养体的LC100浓度低至0.025 mg/mL,优于其他常山、青蒿等中草药制剂[11],同时中药驱虫净散具有抗线虫、绦虫和球虫等活性,有广阔的应用前景。

3.3 羊结肠小袋纤毛虫的药物治疗 目前,以甲硝唑为代表的硝基咪唑类药物是抗滴虫、阿米巴原虫和结肠小袋纤毛虫的首要选择,但其具有潜在的致癌和致突变作用[12],而且容易产生耐药性,因此开发安全、有效、绿色的甲硝唑类药物的替代品已成为必然。本文治疗羊结肠小袋纤毛虫的中药驱虫净散以其广谱、高效、安全的特点,有较高的推广价值。本病治愈后,依然存在摄入结肠小袋纤毛虫包囊的可能性,所以羊场一旦发生该病,就很难清除,要加强饲养管理,定期检查和驱虫,做到早诊断,早治疗。

4 小结

通过临床检查,粪便实验室检验和粪便水洗沉淀物染色镜检等措施,首次确诊了以患严重腹泻症状为特征的羊结肠小袋纤毛虫病例,中西医药敏试验和治疗试验发现,甲硝唑和中药驱虫净散具有较好的治疗效果,其中中药驱虫净散绿色环保、不易产生耐药性,具有广阔的应用前景。

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