家兔卵巢组织玻璃化冷冻保存的实验研究

覃颖，李慕军

(广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心，南宁 530021)

为了避免放化疗对女性癌症患者卵巢的损伤[1]，在放化疗前将卵巢组织冷冻保存，治疗结束后再移植回体内或是行卵巢体外培养，将有可能保存卵巢内大量的原始卵泡储备。另外，相对于胚胎和卵子冷冻，卵巢冷冻保存不需要药物促排卵，不存在诱发某些肿瘤恶变的可能。因此它特别适用于不宜接受卵巢刺激的癌症患者及青春期前的女孩[2-3]。同时，近年来，由于社会及经济原因，使得越来越多的女性结婚及生育的年龄推后[4]。因此年轻女性有望通过卵巢冷冻保存的方式自主选择自己的生育年龄。

相比于最开始的卵巢组织慢速程序化冷冻法，玻璃化冷冻方法作为一种新兴的冷冻保存技术，其目的是使细胞内液体形成玻璃化状态以避免细胞内冰晶形成所造成的对细胞膜和细胞器的机械损伤。Yeoman等[5]研究表明玻璃化冷冻能有效保存猴的卵巢组织，其效果与慢速冷冻法无显著差异。Sanfilippo等[6]采用冷冻管式玻璃化冷冻法保存人类卵巢组织，显示此方法可以使卵泡正常率达到83.6%，且和慢速冷冻法的保存效果无显著差异。Chen等[7]报道新型直接覆盖玻璃化方法(DCV)，降温速率可达15 000℃/min，其对卵巢的保存效果优于传统的玻璃化冷冻方法。半麦管玻璃化冷冻法(HS)由Keros等[8]设计并且成功保存了卵巢组织。本研究选择DCV法和HS法冷冻保存家兔卵巢组织，研究比较这两种冷冻方法的保存效果。

材料与方法

一、实验步骤及主要试剂

1.动物来源：选用健康的新西兰雌性家兔10只，月龄4～5月，体重2～2.5 kg，由广西医科大学实验动物中心提供动物实验场地及技术支持。

2.主要试剂：二甲基亚砜(DMSO，Amresco，美国)，乙二醇(EG，广东西陇)，蔗糖(广东光华科技)，PBS(上海生工生物)。配制玻璃化冷冻所需的预冻液(7.5%EG+7.5%DMSO+PBS)、冷冻液(15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+PBS)及复苏溶液(依据浓度梯度依次为含1.0 mol/L、0.5 mol/L和0.25 mol/L蔗糖的PBS)。

二、实验方法

1.卵巢的获取：经家兔耳缘静脉注射空气处死雌兔，取出其双侧卵巢并立即放入无菌PBS中。在盛放有PBS的培养皿中反复漂洗以祛除组织中的血迹，并切除卵巢周围的脂肪和结缔组织。用薄刀片小心刮去卵巢髓质后，剩下的卵巢皮质用眼科剪切割成大小约2 mm × 2 mm × 1 mm的组织块。随机取每只雌兔2～3块卵巢组织块置于10%中性福尔马林液中固定保存作为新鲜对照组，剩余的卵巢组织块被再次随机分配到DCV组和HS组中。

2.制作半麦管：用眼科剪将0.25 ml麦管的开口端剪成长宽约0.8 mm× 0.3 mm的薄片。制作好的半麦管浸泡于75%酒精中6～8 h，晾干以备用。

3.卵巢组织的玻璃化冷冻：(1)DCV组：我们参考chen等[7]的实验步骤，首先将卵巢组织块置于预冻液中在室温下渗透平衡10 min，再将其移入冷冻液中浸泡2 min。将2～3块卵巢组织放置于冷冻管底部后，借助无菌长镊子迅速将冷冻管浸入液氮中，并确保冷冻管与液氮液面之间的角度要大于45度，这样冷冻组织块表面会附着少量的冷冻液，其表面的冷冻液能使组织块迅速固化并且粘附在冷冻管壁上或是半麦管上，以防止卵巢组织块漂走，随后迅速用长镊子在液氮中将冷冻管的盖子盖上旋紧，并置于液氮中保存。(2)HS组：卵巢组织块同样先置于预冻液中渗透平衡10 min，再浸于冷冻液中2 min。用眼科镊子将2～3块卵巢组织块放置到半麦管开口端的薄片上，然后借助无菌长镊子迅速将半麦管浸入盛放有液氮的浅容器中，浸入液氮时半麦管与液面的倾斜度大于45度。看见组织块成透明玻璃化冷冻状态后，迅速将半麦管放入旁边同样浸于液氮中的冷冻管内，在液氮中旋紧冷冻管的盖子后并置于液氮中保存。

4.复苏冷冻的卵巢组织：于液氮中放置1周后将卵巢组织块解冻复苏。

DCV组：从液氮罐中取出存放有卵巢组织的冻存管，迅速将其投入37℃水浴直至组织块表面的冰层完全溶解，室温下将卵巢组织从冷冻管中取出后依次移入浓度为1.0、0.5和0.25 mol/L蔗糖的PBS中各浸泡5 min，再用PBS漂洗组织块5 min×2次后，将其放入10%福尔马林中浸泡固定。

HS组：在液氮中用长镊子将冷冻管盖子旋开后取出冷冻管内的半麦管，立即将半麦管迅速投入37℃的含1.0 mol/L蔗糖的PBS中浸泡5 min，随后置于半麦管尖端平面处的卵巢块将迅速解冻，解冻软化后的卵巢块就可以从半麦管上脱落下来，漂浮于蔗糖溶液中。随后，在室温下将组织依次移入含0.5、0.25 mol/L蔗糖的PBS中各5 min。最后，将卵巢组织移入PBS中，室温下充分洗涤5 min×2次后，将其浸于10%福尔马林中固定。

5.对冷冻复苏后的卵巢组织进行评估：(1)组织形态学评估：每个组各取20个卵巢组织块，这些组织块在经过10%中性福尔马林液浸泡固定、二甲苯透明、各级浓度酒精逐级脱水后，用石腊将卵巢组织块包埋，将制成的石蜡块进行连续4 μm切片后行HE染色。连续切片中每隔10张取一张在光学显微镜下根据Gougeon[9]的标准观察以单盲法观察卵泡的形态，并分别计数每张切片中形态正常及异常的原始卵泡和初级卵泡。(2)制备电镜标本：每个组各取2个组织块行2.5%戊二醛(pH=7.4)于4℃固定，送往广西医科大学电镜室制做成电镜标本。在透射电子显微镜下观察比较各组中组成卵泡的卵母细胞、颗粒细胞及周边间质细胞的超微结构。

三、数据统计学分析

所有数据均用SPSS 13.0统计学软件进行分析。采用χ2检验评判各组间统计学差异，以α=0.05为检验水准，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、冻融前后卵巢组织形态的观察与比较

1.各组卵泡形态学比较：组织形态学结果显示，DCV冷冻组和HS冷冻组卵巢均遭受不同程度的冷冻损伤。形态正常的卵泡的卵母细胞均保持圆形或椭圆形的结构，未见细胞浆皱缩，未见核固缩，卵母细胞周围的颗粒细胞排列紧密分布均匀，卵泡基底膜完整。相反，形态异常的卵泡卵母细胞形状欠规则，发生细胞浆皱缩和核固缩，且胞浆内出现大量空泡；周围颗粒细胞排列松散甚至缺失，发生核固缩；基底膜部分断裂或缺失。各组中形态正常与形态异常的卵泡如图1所示。冻融前后卵泡形态正常率的变化情况如表1所示。

2.卵巢组织中原始卵泡和初级卵泡形态的正常率和异常率分析：结果显示，相比新鲜对照组，两个冷冻组中卵巢组织在复苏后其原始卵泡的形态正常均显著下降，其异常率较新鲜组显著升高(P<0.05)；初级卵泡的形态正常率较新鲜组均有显著下降(P<0.05)，其异常率较新鲜组均显著上升(P<0.05)；然而，两个冷冻组的原始卵泡及初级卵泡的形态正常率相比较并无显著差异(P<0.05)(表1)。同时，在这两个冷冻组初级卵泡形态正常率的下降较原始卵泡更为明显(P<0.05)。

A：新鲜组中形态正常的原始卵泡(→)和初级卵泡()；B：DCV组中形态正常的原始卵泡；C：DCV组形态异常的原始卵泡；D：HS组形态正常的初级卵泡；E：HS组中形态异常的初级卵泡；各图右上角为各自的低倍全景图图1 冻融复苏后卵巢内卵泡的组织形态学观察(HE染色，×400)

组 别原始卵泡数原始卵泡正常异常初级卵泡数初级卵泡正常异常新鲜组227200(88.11)*27(11.89)*7051(72.86)*19(27.14)*DCV组289210(72.66)79(27.24)9653(55.21)43(44.79)HS组283203(71.73)80(28.27)8950(56.18)39(43.82)

注：与其他两组比较，*P<0.05

二、电镜下超微结构的观察与比较

每组分别选取2块组织块(所有实验组卵泡数合计为20个卵泡)于透射电镜下观察的超微结构。结果显示，新鲜组卵泡(6个)的超微结构完好；DCV组和HS组卵泡(各7个)表现为细胞核的核膜断裂或缺失不完整，核内染色质边集；线粒体异常肿胀以致嵴减少或消失；内质网明显扩张；大量空泡出现于细胞浆内。在DCV组中有3个卵泡的基底膜发生断裂，在半麦管组中也有2个卵泡基底膜发生断裂(图2)。

进一步对两个冷冻组中卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞分别在不同部位发生损伤的细胞数目进行统计分析(线粒体发生损伤定义：细胞内发生损伤的线粒体的数目/线粒体的总数≥50%)，结果表明，对于细胞核的损伤，DCV组和HS组的卵泡，除了卵母细胞的细胞核无损伤，有一部分颗粒细胞和间质细胞的细胞核发生了损伤，DCV组中颗粒细胞和间

A：新鲜对照组中的正常卵泡(×8 000)，形态正常的卵母细胞(O)、细胞浆内形态正常的线粒体(M)、形态正常的颗粒细胞(GC)；B：HS组形态正常的卵泡，卵泡结构完整(×4 000)；C：HS组O细胞膜完整，M形态基本正常；GC细胞膜、核膜均完整，GC核内常染色质分布均匀无边集；GC与O连接紧密，基底膜(BM)完整；间质细胞(S)胞膜完整，核内染色质分布均匀，与GC连接紧密(×15 000)；D：HS组，卵母细胞胞浆内的滑面内质网(ER)异常扩张，部分线粒体形态正常嵴清晰，部分线粒体肿胀、嵴减少或消失(×20 000)；E：DCV组，可见GC细胞浆里出现空泡、核膜完整、核内染色质发生浓缩边集，M肿胀、嵴消失，BM出现裂隙不连续(×15 000)；F：DCV组，卵母细胞胞浆内部分M肿胀、嵴数目减少或消失，M内电子密度降低(×15 000)图2 冻融复苏后卵巢内卵泡的超微结构观察

质细胞中细胞核发生损伤的细胞显著高于HS组(P<0.05)。对于存在线粒体损伤的细胞数占各自细胞总数的百分比，DCV组卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞均显著高于HS组(P<0.05)；对于存在内质网损伤的细胞数占各自细胞总数的百分比，DCV组卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞与HS组无显著性差异(P>0.05)；对于存在胞浆内空泡损伤的细胞数占各自细胞总数的百分比，DCV组卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞均显著高于HS组(P<0.05)(表2)。

表2 两种冷冻方法对卵泡3种细胞不同部位的损伤情况[损伤的细胞数/细胞总数，n(%)]

注：与DCV法相应细胞部位比较，*P<0.05

讨 论

要实现玻璃化状态，必须具备两个条件：(1)通过调整组织块大小和合理冷冻载体的设计以实现足够快的降温速率。(2)通过调整平衡液中冷冻保护剂的种类、浓度、渗透平衡的时间和温度，以提高细胞内冷冻保护剂的浓度促进粘稠玻璃化状态的形成，但同时也不可忽视过高浓度的冷冻剂对细胞的毒性。结合这两个关键因素，1 μl冷冻保护剂的总浓度为40%～60%(W/V，质量/体积浓度)时，降温速率必须达到1 000℃/min以上才能形成玻璃化状态。传统的玻璃化冷冻多采用冻存管或闭合式麦管作为冷冻载体，因冷冻速率较低因而无法实现理想的冷冻效果。近年来，各国学者为了提高玻璃化冷冻降温速度尝试了多种新的冷冻方案。Santos等[10]提出的固体表面玻璃化冷冻法(SSV)，将含有卵巢组织的冷冻液滴在液氮中预冷的固体表面实现玻璃化，卵泡保存效果优于传统玻璃化冷冻法。Isachenko等[11]直接将含组织块的冷冻保护剂以微滴的形式滴入液氮中，这种无载体的微滴式玻璃化冷冻法，其降温速率可提高到20 000℃/min以上，因此也称为超速玻璃化冷冻法。Wang等[12]则提出针浸润玻璃化冷冻法(NIV)，其冷冻效果优于传统慢速冷冻法和微滴法。近年来，有研究指出，玻璃化冷冻对于卵泡的颗粒细胞及卵巢间质细胞具有明显的保护作用，效果可以等同甚至优于慢速冷冻法[13-14]。进一步，有研究指出虽然采用玻璃化冷冻的原始卵泡的正常率与慢速冷冻法相比没有明显差异，但是玻璃化冷冻的卵泡DNA断裂明显少于慢速冷冻法[15]。

本研究采用DCV法和半麦管法这两种新型的玻璃化冷冻方案进行冷冻，这两种方案均是让组织块直接与液氮接触，以达到快速降温的目的，但两种方案的冷冻操作方式不同。在DCV法的操作过程中关键在于要让液氮以最快的速度覆盖接触组织块。在实际操作中发现，在保证组织块不会因为反冲力而冲出冷冻管的范围，尽可能将组织块放置于距离冷冻管口越近的位置，并且浸入液氮时冷冻管壁与液面所成的角度越小，则液氮覆盖组织块所需要的时间就越短，降温速率就越快。但液氮的覆盖时间从冷冻管口底部毕竟存在时间差，不及半麦管法那样与液氮的接触直接和迅速。这两种方案的冷冻相比新鲜对照组，其原始和初级卵泡的形态正常率虽然均有所下降，但仍能保持较高的原始卵泡形态正常率(72.66%和71.73%)。在两个冷冻组中，初级卵泡的形态正常率均明显低于原始卵泡，表明玻璃化冷冻方案更适合保存体积小、代谢率低、细胞器少的原始卵泡。两个冷冻组间原始和初级卵泡的形态正常率无明显差异，说明DCV法与半麦管法冷冻方案对卵泡组织学形态的影响差别不大。

本研究中在液氮冷冻卵巢组织1周后解冻后进行研究，并未有延长冷冻时间。在本课题组既往研究发现冷冻1周和冷冻1个月对卵泡的影响无显著差异。可能的原因是，玻璃化冷冻是一瞬间短暂的过程，也就是说冷冻成功的关键与否在于浸入液氮一瞬间的操作手法，能使卵巢块能够在浸入液氮的一瞬间成功的玻璃化，而不是冰晶化。一旦组织块已经在液氮中形成玻璃化状态，那么在这样的极低温状态下，卵巢的内部细胞活动已经停止，因此只要一直浸在液氮当中，无论冷冻保存的时间长短，卵巢内部的组织形态都不会发生变化。

本实验研究发现，经DCV法和半麦管法这两种玻璃化冷冻方案冻融后的卵巢组织与新鲜组比较，卵泡的超微结构均有不同程度的损伤。结果表明：(1)两种冷冻方案对细胞核的超微结构损伤最小。细胞核的损伤意味着细胞失去固有生命功能和发生凋亡的趋势加快。因此，这两种玻璃化冷冻方案对细胞核具有较好的保存效果，并未对细胞产生致命性的冷冻损伤。(2)两种冷冻方案均对细胞器线粒体损伤最为严重，说明线粒体对冷冻损伤最为敏感。

本研究中采用的DCV法和半麦管法均能有效保存家兔的卵泡，且这两种冷冻方案在动物实验成功的基础上，有望运用于人类卵巢的保存，提高其临床应用性[16]，当然，这仍需要从更多方面去评估和验证。