不同色型玛咖中总生物碱酸水提取工艺的优化

高 斌,李双玲,刘凤静,车文军,冯 励

(云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明 650201)

玛咖(Maca)是南美一年生或两年生草本植物,在南美安第斯山区已经有几千年的栽培历史[1],是不可缺少的作物之一。大量研究表明,玛咖具有改善性功能[2]、抑制前列腺增生[3]、抗疲劳[4]、增强免疫力[5]、缓解更年期综合症[6]和抗氧化[7]等多种功效。玛咖是一种营养丰富的食品资源,其蛋白质含量较高;此外,玛咖还含有玛咖烯[8]、生物碱[9]、芥子油苷[10]、多酚类[11]等多种次生代谢物质,推测这些次生代谢物质与玛咖保健功效有着密切关系。

生物碱是一类广泛分布于植物界中重要的天然有机化合物,生物碱也是玛咖中重要的活性成分之一。研究表明,玛咖生物碱可通过提高动物成熟卵泡小体数量、精子流动性和精子数量,显著提高哺乳动物和鱼类的生育力[12-13]。另外,玛咖中的生物碱通过作用视丘下部和脑垂体,调节肾上腺、甲状腺、胰腺、卵巢等内分泌腺,平衡荷尔蒙,可用于治疗女性更年期综合征[14]。

生物碱提取工艺研究的相关文献报道较多,大多采用溶剂提取法进行提取[15-16]。目前,仅有关于玛咖生物碱回流提取[17]和超声提取[18]的报道,而关于玛咖生物碱的酸水提取还未有报道。酸水提取法的原理是大多数生物碱在植物体内是以盐形式存在,以无机酸水对其进行提取可使生物碱从大分子有机酸盐转变为小分子无机酸盐,从而增大其在水中的溶解度。本实验选择云南丽江所产的黄色、紫色和黑色3种色型的玛咖为原料,以pH2.0盐酸水溶液为提取溶剂,料液比、提取温度和提取时间为考察因素,以玛咖生物碱提取率为指标进行单因素实验,并通过正交试验优化了酸水提取玛咖生物碱的工艺确定其最佳提取条件,以期为玛咖生物碱的提取提供简单、可靠的方法,同时为有效推动玛咖相关产业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玛咖 黄色、紫色、黑色3种色型,产自云南丽江,经过晒干加工为粉末的袋装玛咖粉;乌头碱标准品 纯度≥98%,批号:110799-201106,中国药品生物制品检定所;其他化学试剂 均为分析纯。

BSA124S型精密电子分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司;PB-10/C型标准型pH计 上海精密仪器仪表有限公司;HH-4型电热恒温水浴锅 江苏金坛市环宇科技仪器总厂;UV2450S型紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玛咖粉中总生物碱供试样品溶液的提取 3种色型玛咖粉各称取5.0 g→含0.5%盐酸蒸馏水浸泡12 h→提取液5000 r/min离心10 min,取上清液→等体积氯仿萃取酸水提取液3次→氨水调节提取液pH至10左右→氯仿等体积萃取3次→合并萃取液,回收氯仿→脂溶性生物碱→正丁醇等体积萃取碱性水溶液3次,回收正丁醇→水溶性生物碱。脂溶性生物碱和水溶性生物碱合并,获取3种色型玛咖总生物碱。将3种色型玛咖总生物碱分别合并蒸发浓缩至5 mL,即可获取玛咖总生物碱供试样品溶液[19]。

1.2.2 玛咖样品总生物碱含量的测定 本实验采用比色法对3种色型玛咖样品中总生物碱的含量进行测定。由于玛咖生物碱基础性研究较少,无法获取其标准品,有学者在研究玛咖生物碱时以乌头碱作为标准品[18],因此,本实验也采用乌头碱作为标准品。

用50 mL氯仿溶解50.0 mg乌头碱样品,得到浓度为1.0 mg/mL的乌头碱对照品溶液。

精密吸取玛咖样品溶液及乌头碱对照品溶液各1.0 mL,分别置于25 mL磨口试管中,用氯仿定容。其后根据标准曲线制备方法进行样品的准备,然后在300～700 nm波长范围内进行扫描。结果表明,玛咖样品在410～416 nm处有最大吸收峰,乌头碱样品在412～414 nm处有最大吸收峰,因此选择412 nm为玛咖生物碱的检测波长。

标准曲线的制作:分别量取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL浓度为1.0 mg/mL的乌头碱溶液,将其注入25 mL容量瓶中,用氯仿定容;然后在各容量瓶中分别加入2.0 mL 0.5%溴甲酚绿显色剂和6 mL NaOH-KHC8H4O4缓冲液(pH4.0),振摇2 min;最后将其倒入分液漏斗中静置1 h,使水层和氯仿层分清后,将分出的氯仿层用脱脂棉过滤,在412 nm波长处测定吸光度,制作乌头碱标准曲线。

3种色型玛咖总生物碱含量测定:将1.2.1所获取的浓缩液定容至5 mL,移取1 mL于25 mL容量瓶中,其余与标准曲线操作相同。根据标准曲线找出所获取吸光值所对应的总生物碱浓度,计算出总生物碱含量。玛咖总生物碱提取得率(%)=总生物碱量/干玛咖粉量×100

1.2.3 单因素实验 称取玛咖粉5.0 g 5份,分别用pH2.0的盐酸水溶液100、125、150、175、200 mL进行加热浸提,提取温度设为80 ℃,每次5 h,重复提取3次,考察料液比对3种色型玛咖中总生物碱提取得率的影响。

3种玛咖粉在料液1∶30 (g/mL),提取时间5 h的条件下,分别按70、75、80、85、90 ℃的提取温度处理玛咖,重复提取3次,考察提取温度对玛咖中总生物碱提取得率的影响,筛选出较佳提取温度。

三种玛咖粉料液比1∶30 (g/mL)、提取温度80 ℃的条件下,分别按4、4.5、5、5.5、6 h的提取时间处理玛咖,重复提取3次,考察提取时间对玛咖中总生物碱提取得率的影响,筛选出较佳提取时间。

3种玛咖粉均以料液比1∶30 (g/mL)、提取时间5 h、提取温度80 ℃的相同处理条件,分别按1、2、3次的提取次数处理玛咖,考察提取次数对玛咖中总生物碱提取得率的影响,筛选出较佳提取次数。

1.2.4 正交试验优化酸水提取法 提取条件在上述单因素实验的基础上,选择对玛咖中总生物碱提取得率影响比较大的因素,较好的水平进行正交试验,得到用酸水提取法提取玛咖总生物碱的最优因素水平。实验选取料液比、提取温度和提取时间3个因素为变量,选用3因素3水平正交表进行,对正交试验的操作设计如表1所示(3种色型玛咖)。

表1 酸水提取各因素正交表Table 1 Orthogonal design experiment of acid water extraction

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 乌头碱标准曲线回归方程

乌头碱标准曲线制作结果,得到回归方程为A=2.7653C-0.021,R2=0.9951,A代表吸光值,C代表乌头碱浓度(mg/mL),乌头碱浓度在30～320 μg/mL浓度范围内线性关系良好,可用于样品总生物碱的测定。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对玛咖总生物碱提取得率的影响 料液比对玛咖总生物碱提取得率的影响如图1所示。由图1可知,其他条件一定,当料液比为1∶30 (g/mL)时,黄色玛咖中总生物碱提取得率达到最大,为7.96%;当料液比为1∶25 (g/mL)时,紫色和黑色玛咖中总生物碱提取量达到最大,分别为9.95%、9.44%。故利用酸水提取法对黄色、紫色和黑色玛咖中总生物碱最佳料液比的选择应该分别在1∶30、1∶25、1∶25 (g/mL)处。在本实验料液比梯度内,3种色型玛咖总生物碱最高提取得率的料液比不一致,推测与各总生物碱组成成分存在的差异相关,但这还需要进一步的研究来确定[21],适宜的料液比可使物料中的总生物碱有效溶出。

图1 料液比对玛咖中总生物碱提取得率的影响Fig.1 Effects of proportion of solid and liquidon extracting rate of total alkaloids

2.2.2 提取温度对玛咖总生物碱提取得率的影响 温度升高,气泡中的蒸气压增大,空化强度会降低;随着温度的升高，部分生物碱结构不稳定,发生分解。提取温度对玛咖总生物碱提取得率的影响如图2所示。由图2可以看出:黄色玛咖总生物碱提取得率到80 ℃最高,然后下降,故采用80 ℃为宜,此时玛咖总生物碱提取得率为9.01%。紫色玛咖总生物碱提取率在80～90 ℃范围内逐渐升高,故采用90 ℃为宜,此时玛咖总生物碱提取得率为9.87%;黑色玛咖总生物碱提取得率在70～75 ℃范围内显著升高(p<0.05),到80 ℃时下降,故对黑色玛咖总生物碱的提取采用75 ℃为宜,此时玛咖总生物碱提取得率为9.39%;适宜的温度有利于目标生物碱的析出,但当温度超过一定温度后,玛咖总生物碱的提取得率开始下降。这可能与温度过高导致部分对温度较敏感的生物碱的结构被破坏有关,而且此时高温对玛咖总生物碱的结构破坏作用要大于随温度升高而带来的生物碱析出率增高的影响。

图2 提取温度对玛咖中总生物碱提取得率的影响Fig.2 Effects of temperatures on extractingrate of total alkaloids

2.2.3 提取时间对玛咖总生物碱提取得率的影响 提取时间对玛咖总生物碱提取得率的影响如图3所示。由图3可以看出:黄色、紫色、黑色3种色型玛咖的最佳提取时间分别为5.5、5.0、5.5 h,此时3种色型玛咖总生物碱提取得率分别为8.23%、8.88%和9.56%。适宜的提取时间促进玛咖生物碱的溶出。

图3 提取时间对玛咖中总生物碱提取得率的影响Fig.3 Effect of time on extracting rate of total alkaloids

2.2.4 提取次数对玛咖总生物碱提取得率的影响 提取次数对玛咖总生物碱提取得率的影响如图4所示。由图4可以看出:3种色型玛咖在提取1次和提取2次的玛咖总生物碱提取得率之间存在显著性差异(p<0.05),而部分玛咖在提取2次与提取第3次的提取效果不显著,经过2次提取后,3种色型玛咖中生物碱基本会被比较完全地提取。所以从操作周期考虑,将提取2次作为3种色型玛咖总生物碱的最佳提取次数因素。

图4 提取次数对玛咖中总生物碱提取得率的影响Fig.4 Effects of times on extracting rate of total alkaloids

2.3 正交实验结果

2.3.1 黄色玛咖总生物碱最佳提取工艺条件 正交实验在单因素试验的基础上,以对黄色玛咖总生物碱提取量影响较大的因素和较好的条件作为因素水平进行正交试验,优化出提取黄色玛咖中总生物碱的最佳条件。正交试验结果如表2。

由表2中可以看出,提取料液比的极差最大(0.880),说明料液比对黄色玛咖总生物碱提取得率的影响相对关键,提取时间对提取得率的影响次之,而提取温度对提取得率的影响相对较小。根据正交试验极差分析结果得出黄色玛咖总生物碱酸水提取的最佳提取工艺为A3B1C2,即提料液比为1∶30 (g/mL),取温度75 ℃,提取时间为5.5 h。在此条件下进行了3次验证实验,测得玛咖中总生物碱提取得率为9.89%±0.38%。

表2 黄色玛咖总生物碱提取工艺条件正交试验设计与结果Table 2 Yellow Maca total alkaloid extractionconditions of orthogonal array design

2.3.2 紫色玛咖总生物碱最佳提取工艺条件 正交实验在单因素试验的基础上,以对紫色玛咖总生物碱提取量影响较大的因素和较好的条件作为因素水平进行正交试验,优化出提取紫色玛咖中总生物碱的最佳条件。正交试验结果如表3。

表3 紫色玛咖总生物碱提取工艺条件正交试验结果Table 3 Purple Maca total alkaloid extractionconditions of orthogonal array design

由表3中可以看出,提取时间的极差最大(1.403),说明提取时间对紫色玛咖总生物碱的提取得率影响最大,其次是料液比,最后是提取温度。试验结果表明,各因素影响程度大小为提取时间>料液比>提取温度。即紫色玛咖总生物碱酸水提取工艺条件为A2B3C3,即料液比1∶25 (g/mL),提取温度90 ℃,提取时间为5.5 h,在此条件下进行了3次验证实验,测得玛咖中生物碱提取得率为10.36%±0.58%。

2.3.3 黑色玛咖总生物碱提取工艺条件 正交实验在单因素试验的基础上,以对黑色玛咖总生物碱提取量影响较大的因素和较好的条件作为因素水平进行正交试验,优化出提取黑色玛咖中总生物碱的最佳条件。正交试验结果如表4。

表4 黑色玛咖总生物碱提取工艺条件正交试验结果Table 4 Black Maca total alkaloid extractionconditions of orthogonal array design

由表4中可以看出,料液比的极差最大(1.050),说明料液比对黑色玛咖总生物碱的提取得率的影响最大,其次是提取时间,最后是提取温度。试验结果表明,各因素影响程度大小为料液比>提取时间>提取温度。根据正交试验极差分析得出,黑色玛咖总生物碱酸水提取工艺条件为A1B3C3,即料液比为1∶20 (g/mL),提取温度85 ℃,提取时间为6.0 h。该组合已在正交试验中进行了3次测定,测得玛咖中总生物碱提取得率为10.01%±0.78%。

3 结论

玛咖的种植中有黄、紫、黑3种色型,本实验利用酸水提取法对3种色型的玛咖本的总生物碱提取得率进行优化发现,黄、紫、黑3种色型玛咖最佳提取单因素存在一定的差异。通过单因素试验和正交试验的优化,确定酸水提取3种色型玛咖中总生物碱的最佳条件如下:黄色玛咖的最佳提取工艺条件为料液比1∶30 (g/mL),提取温度75 ℃,提取时间5.5 h,在此条件下获得的玛咖总生物碱提取得率为9.89%±0.38%;紫色玛咖的最佳提取工艺条件为料液比为1∶25 (g/mL),提取温度90 ℃,提取时间5.5 h,在此条件下获得的玛咖总生物碱提取率为10.36%±0.58%;黑色玛咖的最佳提取工艺条件为料液比为1∶20 (g/mL),提取温度85 ℃,提取时间6 h,在此条件下获得的玛咖总生物碱提取得率为10.01%±0.78%。本研究表明,不同色型玛咖中总生物碱的最佳提取条件有一定差异,或与其各色型玛咖生物碱组成成分的差异相关,这可为玛咖生物碱研究者提供一定参考。