南极磷虾粉脱脂前后胰蛋白酶降解产物的变化

姜晓明,胡玲萍,张晓梅,张鸿伟,徐蓓蓓,赵 雪,薛长湖,*

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;2.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,山东青岛 266002)

南极磷虾作为地球上生物蕴藏量最大的物种[1],其资源的开发引起全世界越来越多的关注。南极磷虾的蛋白含量为11.9%～15.4%[2],蛋白的营养高于一般畜禽肉蛋白和牛乳蛋白,含有全部的人体必需氨基酸,必需氨基酸的总量达到212.1 mg/g蛋白质[3]。目前,南极磷虾的主要产品形式有南极磷虾粉和南极磷虾油[4]。脱脂南极磷虾粉为南极磷虾提取虾油后的产物,对其进行酶解可以得到活性多肽。

目前对南极磷虾多肽的研究主要集中在制备工艺优化及活性研究。倪玲等[5]使用胰蛋白酶联合自溶对南极磷虾酶解液多肽的含量、分子量进行分析。李明杰等[6]优化了利用木瓜蛋白酶制备南极磷虾多肽的工艺,并进行了抗氧化活性测定。此外,研究者还对南极磷虾多肽的抑菌活性[7]、ACE抑制活性[8]、抗骨质疏松活性[9]等进行了研究。

液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)已广泛应用于医药、环境和食品等领域[10],特别是食品领域,诸如过敏原检测[11]、食品鉴定[12]、农兽药残留等[13]。近年来,随着基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学及生物信息学的发展,将蛋白与多肽的研究与生物体的基因、转录和代谢相关联,LC-MS技术也成为蛋白与多肽研究的重要手段[10],因此利用LC-MS 对南极磷虾蛋白和多肽的鉴定、定性定量分析及在组学中的更深入研究具有重要意义。本研究以南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉为原料,利用质谱技术研究南极磷虾在加工成虾粉前后的胰蛋白酶降解产物的变化,以期探讨脱脂加工对南极磷虾蛋白及其酶解产物的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾 辽宁省大连海洋渔业集团公司;测序级胰蛋白酶(比活18523 U/mg) 美国Promega公司;质谱级甲酸 美国Sigma公司;乙腈 美国Fisher公司;碘代乙酰胺 美国Sigma公司;二硫苏糖醇、尿素、碳酸氢铵 国药集团化学试剂有限公司。

1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;AB SCIEX Triple TOFTM5600质谱仪 美国AB SCIEX公司;Triple QuadTM5500三重四级杆质谱仪 美国AB SCIEX公司;MQS50001型超纯水系统 美国Millipore公司;AB135-S型精密电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司;A11 基本型分析研磨机 德国IKA公司;CR21G II高速冷冻离心机 日本CHTACHI公司;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;UFC501008超滤管 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 上样前预处理

1.2.1.1 脱脂南极磷虾粉制备 冷冻南极磷虾块在微波源频率915 MHz条件下，微波快速解冻5 min至个体间离散,100 ℃蒸汽处理20 min,沥干水分并在60 ℃下充分干燥,粉碎成粉末[14],加入10倍体积的95%乙醇溶液，在室温下浸泡磷虾粉4 h,期间磁力搅拌并更换一次95%的乙醇,4500 r/min离心15 min。沉淀在室温下挥干乙醇,于60 ℃充分烘干,制得脱脂南极磷虾粉。

1.2.1.2 南极磷虾蛋白提取液的制备 取南极磷虾冻虾虾肉,液氮研磨成粉末状,取1 g冻虾粉于50 mL EP管中,加入10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L NH4HCO3),振荡提取蛋白30 min,高速低温离心15 min(4 ℃,10000 r/min),即为南极磷虾蛋白提取液。脱脂南极磷虾粉取1 g,处理方法同上。

1.2.1.3 南极磷虾蛋白酶解 取上述蛋白提取液上清液100 μL到1 mL EP管中,加2 μL 1 mol/L二硫基苏糖醇，于37 ℃反应1 h。取10 μL 1 mol/L现配的碘代乙酰胺,加入到已经冷却至室温的上述反应液中,室温避光反应1 h。采用10 kDa滤膜8000×g离心超滤30 min后,每次用200 μL碳酸氢铵溶液(50 mmol/L NH4HCO3)洗涤膜上层蛋白质,共洗涤三次。按酶底比1∶50将胰蛋白酶溶液分别加入到上述蛋白溶液中，37 ℃酶解16 h,使酶解彻底[15]。采用10K滤膜10000×g离心超滤30 min,收集下层的肽段滤液,定容至200 μL左右,待上机检测。

1.2.2 液相色谱和质谱条件 色谱柱:C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱温:40 ℃。流动相A:0.1%甲酸-乙腈,流动相B:0.1%甲酸-水;流速:0.25 mL/min;进样量:30 μL;进样时间:46 min;流动相梯度:0～2 min(95% B),2～17 min(95%～80% B),27～37 min(85～65%B),37～39 min(65%～20%B),39～42 min(20%～95% B),42～46 min(95% B)。

质谱扫描范围:350～1500 Da,正离子反应模式,雾化气GS1:35 psi,辅助加热器GS2:45 psi,气帘气压35 psi,喷雾电压5500 eV,离子源温度:500 ℃,解簇电压:100 V,碰撞能量:10 eV,信号强度阈值:2e4。

1.2.3 冷冻南极磷虾和南极磷虾粉蛋白水解物的主成分分析 使用SMICA软件建立PCA模型,进行主成分分析，以可视化样品的总体情况,选择单位方差标度(Unit variance scaling)。

1.2.4 冷冻南极磷虾和南极磷虾粉蛋白水解物的正交偏最小二乘法判别分析 使用SMICA软件建立OPLS-DA模型,进行正交偏最小二乘法判别分析,来筛选两个样品的差异肽段,选择变量除以变量的方差的平方根标度(Pareto scaling)。

1.2.5 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉的差异性肽段分析 对初筛得到差异性肽段在Peak View软件进行色谱峰提取,进一步确认是否为差异性肽段。

1.3 数据分析

利用MarkerViewTMSoftware和ProteinPilotTMSoftware软件进行数据的处理和分析,选用NCBI的南极磷虾数据库(NCBI-Euphausua superba.fasta)进行数据的检索。

MarkerView软件设置如下:最小保留时间2 min,最大保留时间40 min;设置数据的组的分类标志。

ProteinPilot软件参数设置如下:搜库方法:Paragon method;消化:Trypsin;仪器:TripleTOF 5600;物种:None;ID Focus:Amino acid Subtitutions,Biological modifications;Search Effort:Thorough ID;检测蛋白质阈值(Unused Protscore(conf)):>0.05%(10.0%);提交错误发现率(False Discovery rate analysis,FDR)分析报告。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾和南美白对虾的蛋白水解物的LC-MS/MS分析

冷冻南极磷虾和脱脂南极磷虾粉的胰蛋白酶水解产物通过LC-MS/MS检测分析,观察得到的谱图,数据采集情况良好,谱图重现性好。图1为冷冻南极磷虾和脱脂南极磷虾粉蛋白水解产物得到的有代表性的的总离子流色谱图和二级质谱图。结果表明,两种磷虾蛋白的总离子流色谱图和二级质谱图整体具有一定相似性,但局部具有明显差异,并且谱峰比较尖锐,峰形较为对称,这为后续分析打下了良好的基础。

图1 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉的代表性总离子流色谱图和二级质谱图Fig.1 Representative total ion current and stage-two mass spectrum of hydrolysate from two kinds of materials注:A、B分别为南极磷虾冻虾的总离子流色谱图和二级质谱图;C、D分别为脱脂南极磷虾粉的总离子流色谱图和二级质谱图。

2.2 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉降解产物多肽的鉴定及对应的蛋白信息

南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉胰蛋白酶降解产物经高效液相色谱-飞行时间质谱检测的数据在Protein Pilot软件中用NCBI中南极磷虾库进行搜库。在95%的置信度下,南极磷虾冻虾酶解产物中共鉴定到222条多肽,对应的蛋白种类为28种,脱脂南极磷虾粉酶解产物中共鉴定到215条多肽,对应的蛋白种类为27种,同一序列不同修饰视为同一多肽,序列相同但来自不同蛋白的视为不同多肽。南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉的分子量分布如图2所示,鉴定得到的多肽和蛋白信息如表1所示。

表1 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉中被鉴定的多肽及蛋白信息Table 1 Common protein and peptide information of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder

图2 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾虾粉肽段的分子量分布图Fig.2 Molecular weight distribution of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder peptides

2.3 冷冻南极磷虾和南极磷虾粉蛋白水解物的主成分分析(PCA)

本实验采用SIMCA软件对冷冻南极磷虾和脱脂南极磷虾粉蛋白的水解产物的归一化数据进行主成分分析,得到PCA模型的得分图和载荷图如图3所示。得分图可以显示组别,对样品进行归类[16],能够直观的显示数据组之间有无差异,载荷图能反映因子对主成分的贡献大小,在某一具体主成分方向上距离原点越远的因子对此主成分产生的贡献越大[17]。

图3 冷冻南极磷虾和脱脂南极磷虾粉的PCA模型Fig.3 PCA model of hydrolysates of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder注:A为冷冻南极磷虾和脱脂南极磷虾粉的PCA图,B为PCA模型的载荷图。

分析得到的得分图中南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉的样品点集中,A图中左边方形点代表脱脂南极磷虾粉,右边圆形的点代表南极磷虾冻虾,两组样品分别聚集在各自的组中并位于两个不同的区域,说明两个样品可以很好的被区分。载荷图显示,大多数的数据点聚集在一起,而离群的差异数据点,正是导致南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉具有显著差异的原因,可以初步找出差异的肽段。从PCA模型可以看出本实验建立的模型较好,可以进行进一步分析。

2.4 冷冻南极磷虾和南极磷虾粉蛋白水解物的OPLS-DA分析

图4为南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉OPLS-DA及S-plot图。OPLS-DA模型可提供数量更大、更准确的信息。采用所建立的S-plot图筛选导致南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉差异的特征肽段。对两组样本分类贡献较大的肽段通常位于S-plot图中远离中心原点的位置,即离中心的距离越远,对分类的影响越大[17]。

2.5 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉的差异性肽段分析

筛选S型两端的肽段,共得到40条区分南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾粉的差异性肽段,如表2所示。

表2 南极磷虾冻虾和脱脂南极磷虾的差异性多肽信息Table 2 Different peptide information of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder

对筛选出的40条差异性肽段进行AB5500三重四级杆的MRM验证,最终得出四条南极磷虾冻虾中的特征肽段,他们分别为ASVHVDLPGWAK、EDMELQK、LQNAEGEVAALNR和DQVSEALLK,它们肽段断裂图如图4所示,前两条肽段来源于南极磷虾的精氨酸激酶,后两条肽段来源于南极磷虾的原肌球蛋白,具体信息如下:

图4 冷冻南极磷虾和南极磷虾粉蛋白水解物的OPLS-DA及S-plot图Fig.4 OPLS-DA and S-plot of hydrolysate of frozen Antarctic krill and Antarctic krill powder

SEQ ID NO.1:ASVHVDLPGWAK,来自于蛋白arginine kinase[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|588481755,分析发现未发现修饰。其母离子m/z为676.35,子离子m/z分别为:1094.56、844.42、729.39、616.31、547.79,其肽段断裂图如图5A所示。

SEQ ID NO.2:EDMELQK,来自于蛋白arginine kinase[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|588481755,分析发现cleaved A-E@N-term。其母离子m/z为446.71,子离子m/z分别为:648.34、517.30、388.26、275.17、147.11,其肽段断裂图如图5B所示。

SEQ ID NO.3:LQNAEGEVAALNR,来自于蛋白tropomyosin[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|162286973,分析发现其cleaved A-L@N-term。其母离子m/z为692.86,子离子m/z分别为:1143.58、1029.53、958.50、829.45、456.72,其肽段断裂图如图5C所示。

SEQ ID NO.4:DQVSEALLK,来自于蛋白tropomyosin[Euphausia superba],其在NCBI上的Accesion number是gi|162286973,分析发现其cleaved L-D@N-term。其母离子m/z为501.78,子离子m/z分别为:759.46、660.39、444.32、260.20、244.09,其肽段断裂图如图5D所示。

图5 差异性多肽肽段在AB5500上的肽段断裂图Fig.5 Characteristic peptides fracture information on AB5500注:A. ASVHVDLPGWAK;B. EDMELQK;C. LQNAEGEVAALNR;D. DQVSEALLK。

Arginine kinase SEQ ID:

Tropomyosin SEQ ID:

分析导致差异的原因,原肌球蛋白和精氨酸激酶为甲壳类过敏原,加热食物到一定程度可以去除或降低过敏性,原因是蛋白质的空间构象及三维结构在加热条件下会发生变化,破坏蛋白质的空间结构[18],南极磷虾在加工成脱脂虾粉过程中采用了蒸煮,热处理会使原肌球蛋白和精氨酸激酶的空间结构发生变化,这可能是导致南极磷虾冻虾加工成脱脂虾粉后胰蛋白酶降解产物发生变化的原因。此外,在加工过程中还进行了微波解冻,有研究表明微波能使过敏蛋白的空间构型发生改变,使分子间的连接方式发生改变,导致键的破坏和重组[19],这也可能是导致南极磷虾在脱脂加工前后胰蛋白酶降解产物变化的原因。

3 结论

本实验基于飞行时间质谱以及三重四级杆所提供的高质量质谱数据,采用Markerview软件对数据进行筛选,并用SMICA软件数据进行多元统计分析,结果表明所建立的PCA模型和OPLS-DA模型均能够很好地区分两组样品,初筛出的40条差异性肽段通过AB5500的MRM验证，最终筛选出4条南极磷虾冻虾中特有而在加工成脱脂虾粉过程中丢失的特征肽段,它们分别是ASVHVDLPGWAK、EDMELQK、LQNAEGEVAALNR和DQVSEALLK。本实验为南极磷虾加工前后的成分鉴定提供了一种高效、准确的分析方法,可以为多肽组学的研究提供一定的参考。