硫酸软骨素二糖对疲劳致小鼠肾脏炎症的改善作用

刘 芳,曹婉秀,李兆杰,薛长湖,唐庆娟

(中国海洋大学食品科学与工程学院,人类健康实验室,山东青岛 266003)

肾脏是机体排泄的主要场所,也是维持机体内环境的主要器官。具有调节机体水盐平衡、调节血压以及排出机体代谢废物等功能,与机体的工作能力有着密切的联系。当肾脏功能失调时,机体代谢异常,身体的毒素无法及时的排除,长时间的堆积会引发一系列的身体病变。因此,保护肾脏极其重要。然而,随着经济的发展,人们的工作强度随之加大。研究发现,工作强度过大会对肾脏造成严重的氧化损伤[1]。此时,组织会产生大量的氧自由基并发生氧化应激。自由基的大量积累可激活NF-κB等,激活肾脏细胞中IL-6、MCP-1等[2]炎症因子的表达。IL-6、MCP-1等炎症因子过表达会引起肾小管损伤,甚至导致组织坏死。因此,寻找具有抗氧化、有效缓解肾脏炎症、保护肾脏作用的功效因子迫在眉睫。

硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)是一类聚合的多糖化合物,由重复的葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)二糖单位组成,是一类存在于人和动物软骨、结缔组织中的具有特殊生物活性的酸性黏多糖。美国食品药品监督管理局(FDA)认定硫酸软骨素为缓解关节炎的膳食补充剂,在欧洲已经将硫酸软骨素作为处方药或非处方药使用。在国内也将其载入了2010版《中国药典》。近年来,硫酸软骨素被证实具有抗氧化[3]、有抗炎[4-5]、抗过敏[6]等多种生物学功效,被广泛应用于化妆品、功能食品、食品添加剂和医药领域中。作为一类聚合的多糖化合物,硫酸软骨素多糖在小肠中难以吸收,主要通过结肠中肠道菌群的酵解作用[7]降解为二糖的形式再利用,即硫酸软骨素二糖。有研究显示,硫酸软骨素的酶解产物二糖比硫酸软骨素更容易被机体吸收利用且发挥更有效的生理活性[8-9]。目前,大量研究致力于对硫酸软骨素二糖制备方法的优化及体外抗氧化活性的探讨。然而将分离的硫酸软骨素二糖用于抗肾脏炎症的研究尚未见报道。

因此,本文采用鸡软骨来源的硫酸软骨素二糖,利用小鼠疲劳应激模型,探讨其对疲劳诱导的肾脏炎症的改善作用,这将对开发具有保护肾脏功效作用的食品活性因子具有重要的指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

硫酸软骨素二糖(81.21%的二糖的硫酸基团位于N-乙酰半乳糖胺中的C4位置,即CS-4S) 青岛贝尔特生物科技有限公司;C57BL/6J小鼠 健康、雄性SPF级,体重19～20 g,4周龄,许可证号:SCXK(京)2007-0001,购自北京维通利华技术有限公司;丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒 批号20150430、20150250,南京建成科技有限公司;TRIZOL试剂 美国Invitrogen公司;M-MLV逆转录酶 美国Promega公司;2×PCR mix 批号20160608101-2,北京博迈德科技发展有限公司;FastStart Univeral SYBR Green Master(Rox) 美国Roche公司;引物 上海生工生物工程有限公司;β-Actin-HRP抗体美国Santa Cruz Biotechnology公司;兔抗小鼠NF-κB、MCP-1、IL-6多克隆抗体 百灵威科技有限公司;羊抗兔IgG-HRP、MCP-1和IL-6抗体 北京博奥森生物科技有限公司;蛋白质裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(编号P0012)上海碧云天生物技术研究所;脱脂奶粉 美国BD公司。

YLS-10B型电动轮跑步机 山东医学科学院提供;Nanodrop 2000/2000C型分光光度计 美国Thermo Scientific公司;iQ5型荧光定量PCR仪、Model 680型酶标仪 美国伯乐Bio-rad公司;Mastercycler personal PCR仪 德国Eppendorf AG公司;24D型垂直电泳槽和脱色摇床 北京六一仪器厂;SⅡ型半干转膜仪 大连竞迈生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与干预 24只实验小鼠于动物培养中心适应饲养一周后,根据体重随机分成正常组(N组)、疲劳应激组(M组)、正常小鼠灌胃硫酸软骨素二糖组(CS组)、疲劳应激小鼠灌胃硫酸软骨素二糖组(S组)。小鼠饲养在专门动物饲养笼内,室温20～25 ℃,12/12 h光/暗周期,标准饲料喂养,自由饮用蒸馏水。将M和S组小鼠分别置于电动轮跑步机上,持续运动3 h(速度:20 r/min),持续2 d后恢复5 d。实验周期为16 d,共运动6 d。N和CS组保持正常生活状态。实验期间S组和CS组每天灌胃150 mg/kg·bw硫酸软骨素二糖,N组和M组每天灌胃等量的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。第17 d将小鼠摘眼球取血,脱颈椎处死取肾脏。

1.2.2 肾脏组织中SOD活力和MDA含量的测定 将小鼠肾脏组织从-80 ℃冰箱中取出,用RIPA裂解液冰浴匀浆。4 ℃匀浆30 min后,于12000 r/min、4 ℃离心5 min,取上清液。将样品稀释50倍后,用BCA试剂盒检测蛋白浓度。后续操作参考SOD和MDA检测试剂盒说明书。

1.2.3 Real-time PCR方法检测炎症相关基因的表达 将肾组织按照每0.1 g组织加1 mL TRIZOL的比例,4 ℃下匀浆后将匀浆液倒入1.5 mL灭酶离心管中,每管加入200 μL氯仿后，室温静置10 min。4 ℃ 12000 r/min离心15 min,将上清液转移到1.5 mL离心管中,加入与上清液等体积的异丙醇,室温静置10 min。在4 ℃下12000 r/min离心10 min,用75%乙醇清洗后得到沉淀。加适量DEPC水(用焦碳酸二乙酯处理后，并经高温高压灭菌的MiliQ纯水),溶解沉淀。取10 μL 1200 ng/μL RNA加入灭酶PCR小管中,加2 μL随机引物、5 μL 5×M-MLV buffer、dNTP 0.5 μL、RNase Inhibitor 1 μL、M-MLV逆转录酶1 μL和DEPC水4.5 μL。进行反转录,反应程序为:30 ℃,10 min;37 ℃,60 min;90 ℃,5 min;4 ℃ forever。反应结束后即得cDNA样品。然后进行RT-PCR反应,25 μL反应体系为SYBR Green 12.5 μL,上、下游引物各0.75 μL,样品cDNA 2.5 μL,超纯水8.5 μL。反应条件为:95 ℃,10 min;95 ℃,15 s,60 ℃,20 s,95 ℃,15 s(45个循环);65 ℃升温至95 ℃(0.5 ℃/10 s)。毎个基因的mRNA表达量均与GAPDHmRNA表达量相比,引物序列见表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Specific primer sequences for Real time PCR

1.2.4 Western blot检测肾脏组织中蛋白表达 取0.1 g组织,加入预冷的RIPA组织裂解液,至于冰上用匀浆机充分裂解。4 ℃孵30 min,12000 r/min离心5 min(4 ℃),取上清液用BCA试剂盒测定其蛋白浓度。样品经SDS-PAGE电泳,湿转法转膜2 h后转至聚偏氧乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h后,将上述PVDF膜放入适宜浓度的一抗中4 ℃孵育过夜。洗膜后以辣根过氧化物酶标记的二抗于室温下孵育2 h。采用化学荧光法进行成像。以β-actin为内参分析各组目的蛋白的表达量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 硫酸软骨素二糖对疲劳应激小鼠肾脏SOD活力和MDA含量的影响

疲劳应激损伤与组织中自由基的积累息息相关。当肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)无法有效清除组织中的自由基时,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)产生增加,进而造成组织细胞损伤[10]。如图1所示,与N组相比,疲劳应激下M组肾脏组织中的SOD活力略微下降,但无显著性差异(p>0.05),而MDA的含量极显著增加(p<0.01)。由此说明,M组建模成功,疲劳应激会导致机体的氧化应激损伤。当疲劳应激小鼠极显著增加(p<0.01),灌胃硫酸软骨素二糖后,S组小鼠肾脏组织中SOD活力显著升高(p<0.05),而MDA含量极显著下降(p<0.01)。硫酸软骨素二糖也可以极显著增加正常小鼠肾脏组织中的SOD活性(p<0.01),而对MDA含量无显著性的影响(p>0.05)。因此可得,一定剂量的硫酸软骨素二糖具有增加肾脏组织中SOD活性,改善机体氧化应激损伤的功效。

图1 硫酸软骨素二糖对小鼠肾脏中SOD酶活力和MDA含量的影响Fig.1 Effects of chondroitin disccharide on the activity of SOD activity and MDA content in kidney of mice注:*表示p<0.05,**表示p<0.01;图2、图3同。

2.2 硫酸软骨素二糖对疲劳应激小鼠肾脏炎症因子mRNA表达量的影响

如图2所示,与N组相比,疲劳应激M组会极显著增加TGF-β1和NF-κB的mRNA的表达量(p<0.01),进而极显著增加下游IL-6和MCP-1mRNA的表达(p<0.01)。疲劳状态下摄入硫酸软骨素二糖后,与M组相比,S组小鼠肾脏中TGF-β1和NF-κB的mRNA的表达量无显著性变化(p>0.05),而促炎因子IL-6和MCP-1mRNA表达量极显著降低(p<0.01)。在正常状态下,硫酸软骨素二糖(CS组)对小鼠肾脏组织中炎症因子的表达没有显著性的影响(p>0.05)。由此可知,一定剂量的硫酸软骨素二糖的摄入可以改善疲劳诱导的促炎因子IL-6和MCP-的mRNA高表达。

图2 硫酸软骨素二糖对小鼠肾脏中炎症因子mRNA相对表达量的影响Fig.2 Effects of chondroitin disaccharides on the mRNA expression of proinflammatory cytokines in kidney of mice

2.3 硫酸软骨素二糖对疲劳应激小鼠肾脏炎症因子蛋白表达量的影响

如图3所示,与N组相比,CS组的NF-κBp65、IL-6和MCP-1的蛋白表达水平无显著性变化(p>0.05)。疲劳应激状态下,M组小鼠肾脏中相关促炎因子NF-κBp65(p<0.05)、IL-6和MCP-1(p<0.01)的蛋白表达量显著性增加;与M组相比,S组小鼠肾脏组织中NF-κBp65的蛋白表达量无显著性变化(p>0.05),但IL-6和MCP-1蛋白表达量显著性降低(p<0.05)。以上结果表明,一定剂量的硫酸软骨素二糖可以降低肾脏由于疲劳应激引发的炎症因子过表达,改善炎症反应,保护肾脏。

图3 小鼠肾脏中NF-κB p65、IL-6和MCP-1的蛋白相对表达量Fig.3 Relative protein expression of NF-κB p65、IL-6 and MCP-1 in kidney

3 讨论与结论

疲劳损伤与机体炎症和氧化应激紧密相关[11]。前期研究证明,疲劳应激状态下,肾脏皮质呈现白色的缺血水肿状态,组织肾小管形态出现严重损伤[12]。缺血的肾脏组织恢复血流后,组织则会产生氧化应激反应,这也是目前认为肾缺血再灌注损伤的机制之一。灌胃硫酸软骨素二糖(150 mg/kg·bw)能够极显著改善疲劳导致的肾脏组织中抗氧化酶SOD活力并降低MDA含量(p<0.01)。此结果提示硫酸软骨素二糖可以通过改善肾脏的氧化应激保护肾脏的疲劳损伤。

IL-6、MCP-1等炎症因子表达会引起肾小管损伤,甚至导致组织坏死。IL-6是参与炎症反应的重要因子之一[13],其浓度变化与肾脏的病理改变具有一致性[14]。MCP-1是机体中具有特异性趋化作用的趋化因子,其表达量在肾脏病变组织中极显著增加(p<0.01)。本研究结果表明,疲劳应激组(M组)的肾脏组织中IL-6和MCP-1的基因和蛋白表达量均极显著升高(p<0.01)。硫酸软骨素二糖的摄入有效地降低了两者的表达量。因而硫酸软骨素二糖对肾脏组织炎症具有明显的改善作用。

综上所述,一定剂量的硫酸软骨素二糖对疲劳导致的小鼠肾脏炎症具有明显的改善效果,其改善作用可能与其缓解组织氧化应激相关。本研究为硫酸软骨素二糖在改善肾脏应激损伤的功能食品开发中奠定了理论基础。但是,硫酸软骨素二糖的食用剂量以及长期服用后的毒副作用仍需要进一步研究,其保护肾脏的作用机制仍需要进一步探讨。