高通量测序技术在环境微生物领域的应用与进展

艾 铄， 张丽杰,b， 肖芃颖， 张晓凤， 邢志林

(重庆理工大学 a.化学化工学院; b.药学与生物工程学院， 重庆 400054)

环境微生物决定了自然生态功能的强弱和特性，在能量流动、物质循环和系统稳定性维持等方面起着举足轻重的作用[1-2]，对环境污染评估、污染治理、环境修复以及特种功能微生物筛选等领域具有指导意义。而微生物的群落结构及其多样性是微生物生态学和环境科学研究的重点内容，对于开发生物资源，阐明微生物群落与其生境的关系，揭示群落结构与功能的联系，从而指导微生物群落结构功能的定向调控具有重要价值。

微生物群落结构研究最早采用的是传统培养分离方法，该方法存在着分辨率低、需培养等缺点。依照已有的培养技术和方法，只能对自然界中不到1%的微生物进行培养，如海水中为0.001%～0.1%，淡水中约为0.25%，土壤中约为0.3%[3]。随后的荧光原位杂交(FISH)、末端限制性酶切片段长度多态性分析(T-RFLP)、变形梯度凝胶电泳(DGGE)、基因芯片技术等分子生物学技术虽能够绕开分离和培养步骤，但受到样品大小、采集等因素的影响[4]，且许多微生物需在分离培养后才能透彻地对其研究，这导致仅有1%～10%的环境微生物可以进行分析，依旧阻碍了环境微生物群落结构及多样性的深入研究[5]。而当今广泛使用的第二代测序技术(second generation sequencing,NGS)以及第三代测序技术(third generation sequencing,TGS)能够克服上述分子生物学技术的缺点，且因其具有测序通量高、成本低、定量准的特点使其在生命科学领域中得到研究者们的肯定。据报道，科学家第一次进行人类基因组测序花费了40亿元，耗时10年。而在2008年，利用第二代测序技术对人类全基因组进行测序，花费不到100万美元，耗时3个月[6]。2012年，美国Life Technologies公司使用新的高通量测序平台对人类全基因组进行测序仅需1天的时间，花费1 000美元[7]。

作为微生物生态学和环境工程学研究的重点领域，高通量测序技术使得直接研究自然状态下微生物种群结构成为了现实。同时高通量测序技术有助于在矿山、废水、海洋、土壤、大气等差异性环境样本研究中获得了更加完整的DNA。这不仅有利于深入挖掘环境微生物的种类，还把对环境微生物的认识从物种水平上升到基因功能研究水平，极大地拓展了对环境微生物的认识[8-9]。经文献调研可知，截止2014年，国内知网和国外Sciencedirect数据库中高通量测序技术相关文献数量分别约为700篇和3 000篇，但其中高通量测序技术与环境微生物的相关文献数量分别仅占1.7%、2.1%，其余部分主要为人类学、植物学和动物学等方面。而全面介绍高通量测序技术在不同环境介质中应用的综述文章还未见报道。

据此，为了更全面地了解高通量测序技术在环境微生物中的应用，笔者首先对高通量测序技术的发展进行了概述，然后从典型环境介质出发，结合最新成果和课题组研究进展，对高通量测序技术在大气和空气中的微生物变化、海洋微生物多样性、污水生物处理以及土壤功能微生物等方面的应用进行了总结，以期为环境微生物领域的崭新研究及工艺优化提供理论指导。

1 高通量测序技术及发展现状

20世纪70年代Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Maxam等发明的Maxam-Gilbert化学降解法的出现拉开了第一代测序技术的序幕[10]，随后又出现了荧光标记法和毛细管电泳技术[11]。然而双脱氧核苷酸末端终止法和化学降解法操作步骤繁琐，且不能自动化，而荧光标记法和毛细管电泳技术在成本和耗时方面远远不能满足基础学发展的需要。在随后的30多年，生物测序技术取得了重大进展，特别是2005年出现的边合成边测序的454技术、2007年出现的边合成边测序的Illumina技术以及边连接边测序的SOLID技术[12]。以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化，其发展趋势如图1所示。以红色为代表的454测序平台的发展速度最快，从2005年到2011年其读长从100 bp增加到800 bp，测序通量从35 Mb增加到700 Mb；以黄色为代表的Illumina测序平台从2007年到2011年其读长从35 bp增加到150 bp，测序通量从30 Gb增加到600 Gb；以蓝色为代表的SOLID测序平台从2007年到2010年其读长从35 bp增加到85 bp，测序通量从13 Gb增加到320 Gb。这些技术是将片段化的基因进行接头连接形成单链，然后用不同的方式进行PCR扩增产生更多的单分子序列。随后通过引物杂交和酶的延伸实现序列的测定，检测每一步反应所产生的信号来获得测序数据，最后由计算机分析获得完整的序列信息[13]。

2008年第三代测序技术浮出了水面，如Helicos biosciences的tSMSTM技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术[14]。第三代与第二代测序技术的特性比较如表1所示。总体而言，由于第三代测序技术采用单分子测序，具有更快的数据读取速度，读长普遍增加，运行时间大大缩短，且测序过程无需进行PCR扩增[15]。PacBio(SMRT)最长读长可达到4 500 bp，比读长最长的Roche 454平台增长了 3 700 bp，其最短运行时间为0.5 h，比耗时短的Ion PGM减少了2.5 h。且PacBio(SMRT)也运用了边合成边测序的思想[16]，模板与DNA聚合酶结合，4种碱基(即是dNTP)用4色荧光来标记，在碱基配对阶段，加入不同的碱基,会发出不同的光，根据光的波长和峰值来确定碱基类型。而表中Oxford Nanopore是利用电信号和一种具有共价分子接头的特殊纳米孔来测序[16]，DNA碱基通过纳米孔时，会使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，电子设备通过检测这些变化来鉴定所通过的碱基。可见，第三代测序技术比第二代测序技术在测序原理上也有较大的提升。但由于第三代测序技术还不成熟，国内外测序公司运用较少，华大基因等国内主要测序公司均以Illumina的HiSeq和MiSeq测序仪为主要测序平台。

红色：454测序平台；黄色：Illumina测序平台；蓝色：SOLID测序平台

表1 典型高通量测序平台特性比较

2 高通量测序技术在气体微生物中的应用

近年来，由于人类健康、空气污染及环境质量等问题逐年增长，大气微生物渐渐成为国内外研究的热点。研究者已在大气微生物的来源、大气微生物污染与评价、环境因素对大气微生物的影响和大气微生物粒谱范围等方面进行了大量研究。而如今，大气微生物进入了群落多样性的新研究领域。

2.1 室内空气微生物群落多样性研究

该领域研究的目的主要是通过分析室内空气微生物群落结构及多样性推测对人类健康的影响。相关研究目前还处在初级阶段，国内的相关报道还较少。Hewitt等[25]通过对环境微生物的rRNA基因序列进行焦磷酸测序研究了3个大都市办公室里的微生物多样性，研究表明男女性之间的办公室微生物丰度具有较大差异。该实验同时运用了培养细胞计数法和高通量测序技术测定细菌丰度，突出了高通量测序评估微生物多样性快速和彻底的优点，对研究者们在多种测序方法的结合使用方面有了一定的启示作用。同年，Hewitt等还发现了人类对空间的占用会提高空气微生物的浓度，这可能使人们对暴露于室内的某些感染与非感染的细菌产生不良健康后果[26]。该实验充分展现了高通量测序技术在研究细菌基因组和进化种群特征方面的应用。此外，地理位置、建筑设计类型、采集器的选择及空气采集时间长短等因素都会影响微生物的群落结构及多样性变化[27]，从而通过决定微生物组成和多样性来理解其生态和进化关系。Hoisington等[28]利用高通量测序研究了采集器的选择及不同采集时间内室内微生物的变化关系，以此来评估室内微生物因不同条件因素而产生的差异，这在室内微生物多样性研究方面具有一定的参考价值。同时，一些研究者还对禽畜生活的室内环境微生物进行了研究，发现猪场建筑物中的微小气候变化，特别是空气流速、PM2.5和总悬浮颗粒的变化会严重影响细菌丰度及多样性的变化，并发现冬季时六四环素耐药基因出现的频率比夏季高。随着高通量测序技术的更加成熟，室内微生物群落多样性研究可为人类健康提供更多的参考依据。

2.2 室外大气微生物群落多样性研究

由细菌、放线菌、霉菌、病毒和孢子等生命活性物质微粒组成的空气微生物以微生物气溶胶的形式游离于大气环境中，是大气生态系统的重要组成部分。近几年，国内外许多研究者通过微生物气溶胶对地球底层大气和对流层上部等环境微生物的群落组成、多样性、时空动力学以及其对生态系统的影响等方面展开了研究[29]。大气中的主要微生物类型为细菌，且微生物的环境来源(如土壤、水体、植物)和季节变化是影响微生物群落结构变化的两大主要因素[30]。Robert等[31]利用定量PCR和Illumina技术对意大利米兰城市地区的大气中细菌群落进行了研究，研究表明在冬季时细菌的丰度低于其他季节，细菌群落的优势菌包括Actinobacteridae(放线菌亚纲)、Clostridiales(梭菌目)和Sphingobacteriales(鞘脂杆菌目)，且大量微生物来源于土壤和植物中。Natasha DeLeon-Rodriguez等[32]研究加勒比海上层空气的微生物群落，研究表明细菌为加勒比海上层空气中的主要微生物类型，飓风气溶胶中具有大量的新细胞，其中有17种细菌分类群利用C1-C4化合物作为生长源。

近年来，北京雾霾天气受到研究者的高度重视，2013年清华大学环境学院和医学院的研究人员利用Illumina HiSeq2000对雾霾空气微生物宏基因组进行测序研究。该研究在种的分类水平上对细菌、真菌、古菌和dsDNA病毒等空气微生物进行鉴定，发现雾霾空气中约有1 300种微生物。其中PM2.5样品中细菌读数占86.1%，真核生物读数占13%，古菌读数占0.8%，病毒读数占0.1%，而PM10样品中细菌读数占80.8%，真核生物读数占18.3%，古菌读数占0.8%，病毒读数占0.1%，且大量微生物与土壤相关(图2)。此外，这些微生物中虽大多数对人类不致病，但确定了几种呼吸道过敏原和病原微生物的序列[33]。室外(特别是城市)大气微生物结构及多样性的研究，对深入理解城市空气污染及其影响因素具有重要意义。尤其是高通量测序技术与宏基因组的完美结合，能够进一步推进空气环境治理研究，为大气环境的污染治理提供了更丰富的生物信息。

从上述可知，高通量测序技术在气体微生物中的应用已有一些报道，也体现出了高通量测序技术在群落结构及多样性研究等方面发挥的巨大作用，但大多数只对气体微生物直接的群落结构及多样性研究，而对于高通量测序技术在大气微生物功能菌的筛选等方面的应用还未见报。

图2 收集的PM样品特性

3 高通量测序技术在水环境微生物中的应用

3.1 原生环境中微生物多样性变化研究

海洋微生物因在多种生源要素和能量传递方面的重要化学循环作用而成为研究者的主要研究领域。研究表明，在相同的水生环境中，不同深度的优势微生物类群各不相同。譬如，北极水域表层水体微生物多样性的优势种为蓝藻，深层水体(200～1 500 m)丰度最高的优势种为变形菌门[34]。此外，微生物群落结构除随时空变化外，还受温度、pH值等其他环境条件影响。Maugeri等在Illumina测序技术的辅助下研究意大利Panarea岛浅海热液系统中微生物群落结构的组成及优势菌，研究表明沉积物和流体中具有不同的群落结构，其优势菌分别为Rhodovulum(小红卵菌属)和Chlorobium(绿菌属)，且所获得序列的原核生物对浅海热系统中的C、Fe和S循环起着关键作用[35]。不同温度下海洋热带地区中沉积物和海水中原核微生物群落结构及组成不同，研究发现Panarea岛屿的一个活跃的水热地区在低温和高温的微生物群落的优势菌都为细菌，微量菌都为古生菌，且不同温度下的样品具有不同优势菌属的数量比[36]。董逸等[37]利用高通量测序技术对我国黄东海典型海域进行微生物群落结构及环境变化对其影响的研究。研究表明：前5个月中，每月各水层具有相似的群落结构，而后6个月却具有不同的微生物群落结构，其中温度和盐度对细菌群落结构的变化影响显著。可见，除DNA测序技术中Sanger 测序法在海洋微生物中得到广泛应用外，如今，高通量测序方法也越来越多地应用于海洋微生物生态学的研究。高通量测序技术能够揭示海洋中极低丰度的微生物，发现更多新微生物类群，但在各分类阶元都存在不能确定的分类信息。对此，可将荧光定量、克隆等技术与高通量测序技术结合，或将多种高通量技术结合使用，尽可能地减少测序结果的不确定性。

3.2 次生环境水体中微生物的多样性研究

随着城市生活垃圾的积累及工业生产中的废水排放，水污染问题越来越严重[38]。水污染造成了水体营养负荷增加，破坏了藻类、无脊椎动物和鱼类群落结构，同时也极大地影响了水中微生物的多样性和群落结构。

2008年，研究人员就开展了利用磷焦测序研究污水处理厂的抗生素抗性质粒的研究[39]。到目前为止，已有许多关于废水处理厂微生物及饮用水系统微生物方面的应用研究运用了高通量测序技术[40]。Man等[41]利用454焦磷酸测序技术研究具有不同处理方法的污水处理厂中的微生物群落。研究表明，Proteobacteria(变形杆菌)和Bacteroidetes(拟杆菌)是样品中的优势菌群，处理方法的差异可能改变微生物的群落结构。Zhang等[42]通过高通量测序技术研究了光合细菌作为添加剂对废水处理系统中微生物群落结构及多样性的影响。研究表明，添加光合细菌的样品组比对照组具有更高的微生物多样性，且能够改善水质量。

Daisuke等[43]利用高通量测序技术对Kathmandu Valley地区的浅层地下水生物污染进行了研究，结果表明11个地下水样品中有10个受到大肠杆菌的严重污染，此外DNA微阵列分析结果还揭示了37个病原种类的存在。Xiao等[44]利用454焦磷酸测序技术研究了农村生活污水以及制革厂、服装厂和纽扣厂的排放污水对河流微生物生态系统的影响。结果表明，农村生活污水的细菌丰度最高，而制革厂的细菌丰度最低，且4种样品中存在相似的微生物种类，可知不同废水会潜在地影响河流生态系统的自然变化，导致河流生物同质化。同年，他们对特定猪场和农场饭店旁的河流微生物生态系统进行了研究[36]，发现猪场和农场饭店排放的污水使河流沉积物及河水的细菌多样性和丰度都显著降低，且猪场污染物对河流群落多样性的影响较大。随着高通量测序技术的广泛应用，将会有更多的水体环境问题得以揭示，譬如消毒副产物对饮用水的生物多样性影响、湖水中重金属的迁移转化问题等，相关成果也会为水处理系统的优化设计提供有益的指导。

4 高通量测序技术在土壤微生物中的应用

土壤微生物在分解转化各种有机物和地球化学循环方面起着重要的作用[45]，其物种结构、遗传多样性和功能特性亦受到研究者的广泛关注。据估计，每克土壤中最多可含有大约100亿个微生物个体[46]，微生物种类和数量因土壤类型、季节变化、土层厚度与层次不同而发生变化，高通量测序技术为土壤多样性的研究及土壤生态功能方面的研究提供了重要的技术支撑。

4.1 微生物群落的土壤理化性质响应

人类的生产生活改变了土壤本身的理化性质，造成土壤微生物群落演变。早期研究表明，草地和林地为土壤微生物提供充足能源，当草地或林地变为耕地后，其微生物量相对减少[47]。McGuire等[48]利用高通量测序技术发现再生的原始森林土壤中真菌的群落结构和功能变化显著。而长期施肥则会改变土壤氮源和碳源的利用量，使得土壤微生物在土壤垂直梯度上具有明显的群落结构差异[49]。卞碧云等[50]利用高通量测序技术研究氮肥对氨氧化微生物的影响，研究表明氮肥量的不同会使氨氧化细菌微生物群落结构产生明显的差异，氨氧化古菌微生物群落结构基本稳定，而“活跃的”氨氧化细菌和古菌都会发生明显变化，其中氮肥用量增加会对“活跃的”氨氧化细菌中Nitrosospira.splNsp 65-like group类群和Nitrosococcus watsonii sp.nov类群的生长分别产生抑制和促进作用。

借助高通量测序技术能够多种环境因素同时分析，直观全面地反映土壤微生物与生态条件的相互关系和影响，从而明细微生物群落结构的演变规律，丰富环境生态学知识，进而探索更有效的土壤管理方法，为人类合理利用土壤资源提供了有利依据。

SD：东莱芜；GD：广东深圳；SH：上海老港；CQ：重庆长生桥；OM：有机质；TN：总氮；TP：总磷；硝态氮；铵态氮

4.2 高通量测序技术在土壤功能微生物筛选方面的应用

土壤微生物长期在特定环境下具有了某些特定的功能，是环境生态系统中C、N和其他养分流的关键。研究表明氨氧化细菌控制着消化作用的主要步骤，对土壤生态系统的保持和移动性起着重要的作用，且氨氧化细菌在高底物和高营养条件负责了大部分的氨氧化反应[56]。在高通量测序技术的辅助下，研究者还对土壤中功能微生物进行了深入探究。徐瑛等[57]将脱硫菌的筛选与新一代高通量测序技术相结合，发现土壤中Pseudomonas(假单胞菌属)、Ochrobactrum(苍白杆菌属)等多种脱硫功能菌。Kim等[58]在实验室模拟垃圾填埋场甲烷降解的覆盖层，通过基于DNA和RNA的核糖体标签焦磷酸测序对细菌群落进分析研究，研究表明甲烷氧化菌活跃区域RNA占80%，而DNA占20%。DNA与RNA的比较表明只基于DNA的分析可能会低估甲烷氧化菌的活跃成分。课题组从矿化垃圾中富集混合菌群，并利用其静息细胞进行了共代谢降解三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)的研究，结果表明该菌群对TCE有较强的亲和力和耐受性，且TCE降解符合Monad模型[59]。随后，课题组利用高通量测序技术对TCE驯化后典型垃圾填埋场覆盖土中功能微生物进行了属分类水平下的生物群落结构变化分析，结果见图4。研究发现覆盖土中Methylocystis(甲基孢囊菌属)、Methylobacillus(甲基菌属)、Methylophilaceae_uncultured(嗜甲基菌属)、Arthrobacter(节杆菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)等多种共代谢TCE功能菌。此外，课题组开展了铜离子浓度对三氯乙烯好氧生物降解影响的研究。如表2所示，铜离子浓度的变化影响了覆盖层混合菌群的结构和活性，进而影响了TCE降解机制。随着铜离子浓度的增加，II型甲烷氧化菌Methylocystaceae百分含量(36.1%到75.42%)显著增大，这说明了共代谢降解TCE成为了主要降解机制，而直接以TCE为碳源的Lactococcus(乳球菌属)、Methylophilus(嗜甲基菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)等功能微生物的百分含量都显著降低，甚至消失[60]。

利用高通量测序技术，能够获得土壤中微生物物种、结构、功能以及遗传多样性等方面的丰富信息，可根据样品本身的群落结构设计功能菌的筛选方案，避免了传统筛菌的盲目性。尤其是填埋场这种次生环境，在生活垃圾稳定化过程中蕴含了大量的功能微生物菌群，利用高通量测序技术能够探索出覆盖土功能菌筛选的新方法，相关成果将极大地拓展填埋场覆盖土层功能微生物的工程应用前景。

图4 属分类水平下覆盖土微生物群落结构变化

表2 铜离子处理覆盖土混合菌的高通量测序结果

5 展望

高通量测序技术客观地揭示了环境微生物的群落结构、多样性及进化关系，使得微生物宏转录组和宏基因组等方面的基本研究策略发生变化，研究步骤得以简化，研究周期得以缩短，并且能够获得更加丰富的数据。同时，它的发展为环境微生物在物质循环、生态系统调节及污染处理等方面的深入研究提供了机遇，也为极端环境下(如耐重金属、PoPs持续性有机污染物)的功能微生物在耐受性驯化、代谢机理研究等方面提供了有力支撑。然而高通量测序技术也存在着一些缺点。

1) 它可能会高估或低估一些微生物类群的相对丰度及多样性等，例如高通量测序针对环境中所有的DNA样品，死的生物也可能被检测到。将高通量测序技术与传统技术的结合仍然具有很大的空间。

2) 高通量测序技术产生的海量数据分析难，这种海量数据使得生物信息学分析面临挑战，加大了土壤学或微生物学研究者对高通量测序结果分析的难度，新统计学方法和分析软件的开发成为当前的迫切需求。

3) 高通量测序仪价格昂贵，动辄几百万元， 一般的小型实验室难以承受。

虽然高通量测序技术过程中依然存在一些问题，但是其检测快、通量高和信息丰富等特点，使其在微生物研究中的应用具有独特优越性。所以应当谨慎地解释分子技术所产生的微生物信息数据，结合多种分析方法得到更准确的结论。而海量数据的处理使得环境微生物学从生物学领域延伸到数学、自动化、计算机等许多科学领域，这必将拓展更多的新兴研究领域，更好地发挥高通量测序技术的优势。