补喂硫酸钠、微量元素及其组合对哈萨克孕马3种雌激素硫酸盐日排出量的影响

李晓斌 陈 晖 赵 芳 谢景龙 杨菊青 杨开伦

(新疆农业大学，新疆肉乳用草食动物营养实验室，乌鲁木齐830052)

孕马尿中含激素类物质、有机酸、无机酸、无机盐等多种有效成分。激素类物质均以结合的、非结合的雌激素、孕激素及雄激素形式存在于孕马尿中[1-3]。研究显示，孕马尿中雌激素的含量在70～130 mg/L，而一个孕期内孕马尿中雌激素含量可达50～100 g/匹[4]。因此，孕马尿成为获取天然雌激素物质的主要原料。结合雌激素是孕马尿中有效的生物成分之一，是雌激素通过葡糖醛酸化和硫酸盐化作用形成的激素类物质。孕马尿中的雌激素硫酸盐是主要以雌酮硫酸钠(sodium estrone sulfate，Es-S)、马烯雌酮硫酸钠(sodium equilin sulfate，Eq-S)、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠(sodium 17α-dihydroequilin sulfate，2H-Eq-S)的形式存在，三者含量之和占激素类物质总量的90%以上，是孕马尿中结合雌激素的指标性成分。研究证明，结合雌激素在临床上主要用于激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)，以缓解因雌激素不足引起的临床症状[5]，主要治疗和预防女性绝经后出现的更年期综合征，防治骨质疏松症[6]，预防老年痴呆症和冠心病[7]等。目前，关于孕马尿中结合雌激素的相关研究主要集中在萃取方法、测定方法以及不同妊娠阶段含量的变化方面[8-10]，对于提高孕马尿中结合雌激素含量的研究鲜见报道。哈萨克马是新疆主要的马种，具有乳、肉、役兼用的性能，耐粗饲、耐高寒、适应能力强。哈萨克马是新疆地区提供孕马尿原料的主要马种，提高哈萨克孕马尿中结合雌激素的含量可增加牧民的经济收入。因此，本试验以妊娠中后期的哈萨克孕马为研究对象，通过补喂硫酸钠、微量元素及其组合探究其对孕马血浆及尿中3种雌激素硫酸盐(雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠)含量的影响，为维持哈萨克马孕期激素正常分泌和提高孕马尿中结合雌激素的含量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验时间：2012年11月至2013年3月；试验地点：新疆伊犁哈萨克自治州新源县阿勒玛勒乡。

1.2 试验动物选择

试验以配种日期相近的原则选择年龄5～7岁、第2～4胎妊娠中期的哈萨克母马34匹。

1.3 试验设计

将34匹哈萨克孕马随机分为4个组，分别为对照组9匹、试验Ⅰ组9匹、试验Ⅱ组8匹、试验Ⅲ组8匹。所有孕马在相同的饲喂条件下饲养，试验第1～30天，对照组每匹马每天补喂50 g玉米粉，试验Ⅰ组每匹马每天在补喂50 g玉米粉的基础上再补喂6 g硫酸钠(购自天康生物股份有限公司，分析纯)，试验Ⅱ组每匹马每天在补喂50 g玉米粉的基础上再补喂5 g微量元素(购自天康生物股份有限公司，包括铜、锌、铁、锰、硒，含量分别为1.34%、5.38%、6.72%、5.38%、0.014%)，试验Ⅲ组每匹马每天在补喂50 g玉米粉的基础上再补喂6 g硫酸钠和5 g微量元素；试验第31～90天，对照组每匹马每天补喂100 g玉米粉，试验Ⅰ组每匹马每天在补喂100 g玉米粉的基础上再补喂12 g硫酸钠，试验Ⅱ组每匹马每天在补喂100 g玉米粉的基础上再补喂5 g微量元素，试验Ⅲ组每匹马每天在补喂100 g玉米粉的基础上再补喂12 g硫酸钠和5 g微量元素。整个试验期为90 d。补喂玉米粉的目的是让硫酸钠和微量元素与玉米粉混合，利于马匹采食硫酸钠和微量元素。

1.4 饲养管理

所有试验马匹均采用舍饲，每天分别于饮水时在运动场活动2 h(12:00—13:00、18:00—19:00)。将马匹每天的玉米粉、硫酸钠及微量元素补喂量平均分2等份，分别于09:00和20:00用料盆补喂，确保每匹马补喂量准确及采食干净。试验马匹饲喂的粗饲料为青干草和苜蓿，饲喂比例为4∶1。每天饲喂5次，分别于09:00、12:00、16:00、20:00和00:00饲喂，确保自由采食。粗饲料营养水平见表1。

表1 粗饲料营养水平(干物质基础)

1.5 样品采集及处理

于试验第30天的08:30空腹颈部静脉采集孕马血样。用肝素钠真空管采集血样，轻轻摇动采血管，然后2 190×g离心15 min，制取血浆，标记后于-20 ℃冷冻保存。

1.6 样品测定

采用高效液相色谱仪测定孕马血浆及尿中的结合雌激素——雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的含量。

1.6.1 色谱条件

1.6.2 流动相

缓冲液配制：称取三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.00 g、磷酸二氢钾(KH2PO4)1.00 g，转移到1 L容量瓶中，用双蒸水溶解、定容，混匀，测定pH(应为7.00±0.01，否则用盐酸或氢氧化钾溶液调节)。

流动相为缓冲液∶乙腈(色谱纯)∶甲醇(色谱纯)=680∶240∶80(V/V/V)，充分混合，0.45 μm滤膜抽滤，超声波脱气1 h。

1.6.3 血浆处理及进样量

土墙日光温室一般南北跨度9～10m、脊高4.2～4.5m、东西长度60～110m，每座温室的室内面积不小于667m2，个别土墙日光温室跨度达到15m，脊高6.5-7.5m[1]。土墙日光温室墙体采用就地取土，堆土、机械碾压、挖机削平削齐成墙，墙体顶端厚度1.8-2.3m，基部厚度3.5-5.5m，日光温室内下沉为0.5-1.5m之间，下沉较大的形成半地下式日光温室，温室内采用单立柱骨架和无立柱骨架。配备保温被、电动卷帘机、蓄水池等，大部分温室后墙(或山墙)掏洞入室，配建看护房，或以门帘替代看护房。也有相当数量的温室直接在前棚面，分割棚膜，设门入室。

将血浆样充分解冻、混匀，取0.5 mL置于5 mL带盖塑料试管中，加入在4 ℃冰箱预冷的三氯甲烷2 mL，充分混匀，3 500 r/min离心15 min，小心、准确地吸取上层液(三氯甲烷比重大，在离心管中的下层液)0.3 mL，转移到1.5 mL Eppendorf管中，加入等体积的色谱纯甲醇0.3 mL，混匀，置于4 ℃冰箱，待测。上样前用小型离心机12 000 r/min离心5 min，取出后吸取10 μL进样。

1.6.4 尿样处理及进样量

将孕马尿样充分解冻、混匀，取0.2 mL置于1.5 mL Eppendorf管中，加蒸馏水0.8 mL，混匀，4 ℃下以12 000 r/min离心10 min；取0.4 mL离心上清液到1.5 mL Eppendorf管中，加蒸馏水0.4 mL，混匀；取0.2 mL稀释后的上清液到1.5 mL Eppendorf管中，加入0.2 mL色谱纯甲醇，混匀，吸取10 μL进样。

1.7 数据处理

试验数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0软件中的one-way ANOVA程序进行方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 补喂硫酸钠、微量元素及其组合对哈萨克孕马血浆中雌激素硫酸盐含量的影响

由表2可知，血浆中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠含量各组间均差异不显著(P>0.05)。但是，补喂硫酸钠的试验Ⅰ组以及补喂硫酸钠与微量元组合的试验Ⅲ组血浆中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的含量均比对照组高，试验Ⅰ组分别比对照组提高8.33%、10.00%和8.11%，试验Ⅲ组分别比对照组提高12.50%、17.50%和8.11%。

表2 补喂硫酸钠、微量元素及其组合对哈萨克孕马血浆中雌激素硫酸盐含量的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 补喂硫酸钠、微量元素及其组合对哈萨克孕马尿中雌激素硫酸盐含量的影响

由表3可知，随着孕马妊娠的进行，孕马尿中3种雌激素硫酸盐的含量均呈先升高再降低的趋势。在试验期内的各采样时间点，各试验组孕马尿中3种雌激素硫酸盐的含量与对照组均无显著差异(P>0.05)，但各试验组孕马尿中3种雌激素硫酸盐的含量在数值上均高于对照组。试验第30天时孕马尿中3种雌激素硫酸盐含量最高，此时试验Ⅲ组孕马尿中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的含量达到155.35、75.48、40.92 μg/mL。

表3 补喂硫酸钠、微量元素对哈萨克孕马尿中雌激素硫酸盐含量的影响

2.3 补喂硫酸钠、微量元素及其组合对哈萨克孕马尿中雌激素硫酸盐日排出量的影响

由表4可知，试验期间孕马日排尿量在3.54～5.34 L，平均为4.33 L，各采样时间点各试验组孕马的日排尿量与对照组均无显著差异(P>0.05)。3种雌激素硫酸盐日排出量数据显示，试验第0天，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的日排出量极显著低于对照组和试验Ⅰ组(P<0.01)。各组孕马3种雌激素硫酸盐的日排出量均在试验第30天达到最高值，此时试验Ⅰ组、试验Ⅲ组雌酮硫酸钠和马烯雌酮硫酸钠的日排出量

显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)，同时试验Ⅲ组17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的日排出量也显著高于对照组(P<0.05)。试验第60天，试验Ⅰ组、试验Ⅲ组3种雌激素硫酸盐的日排出量均极显著高于对照组(P<0.01)。试验第90天，试验Ⅲ组雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的日排出量显著高于对照组(P<0.05)，马烯雌酮硫酸钠的日排出量极显著高于对照组(P<0.01)。以上结果显示，给孕马补喂硫酸钠和微量元素的组合能够显著或极显著提高孕马尿中雌激素硫酸盐的日排出量。

3 讨 论

机体合成的结合雌激素主要有2类：一类是在雌激素C-3上通过葡糖醛酸化作用生成的含有葡糖醛酸基团的代谢物；另一类是在雌激素C-3上通过硫酸盐化作用生成的含有硫酸盐基团的代

谢物。被结合后的雌激素失去与雌激素受体结合的能力，以硫酸盐及葡糖醛酸化物的形式随尿液排出。研究表明，正常人血浆中雌激素硫酸盐的含量高于雌激素葡糖醛酸的含量[11]。因此，雌激素硫酸盐是机体中起主导作用的结合雌激素。

表4 补喂硫酸钠、微量元素及其组合对哈萨克孕马尿中雌激素硫酸盐日排出量的影响

续表4时间 Time指标 Indices对照组Control group试验Ⅰ组Trial group Ⅰ试验Ⅱ组Trial group Ⅱ试验Ⅲ组Trial group Ⅲ第90天 Day 90日排尿量Urine daily output/(L/d)3.71±0.404.30±1.134.14±0.424.48±0.91雌酮硫酸钠日排出量Sodium estrone sulfate daily output/(mg/d)426.43±45.53b529.87±140.02ab499.48±50.42ab591.31±120.43a马烯雌酮硫酸钠日排出量Sodium equilin sulfate daily output/(mg/d)146.06±15.6Bb229.01±60.52Aa197.94±19.98ABa245.64±50.03Aa17α-双氢马烯雌酮硫酸钠日排出量Sodium 17α-dihydroequilin sulfate daily output/(mg/d)99.72±10.65b136.45±36.06a111.26±11.23ab135.21±27.54a

孕马尿中富含雌激素类物质[4]，研究显示，每升孕马尿中雌激素类物质的含量为70～130 mg，在一个孕期内形成的雌激素类物质为50～100 g/匹。孕马尿中的雌激素类物质主要以雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠等结合态硫酸钠盐形式存在，三者之和占雌激素总量的90%以上。影响孕马尿中结合雌激素含量的因素很多，包括年龄、胎次、妊娠阶段、饲养管理等[18]，在相同的生理阶段，饲养管理可能是影响结合雌激素合成的主要因素。研究报道，在硫酸钠的作用下，给大白鼠和小白鼠补喂对乙酰氨基酚可以增加它们血液中硫酸盐和肝脏中PAPS的含量[19-20]。Klaassen等[21]报道PAPS的含量在正常生理条件下决定了雌激素硫酸盐的含量，影响PAPS合成最重要的因素是组织中硫酸盐的含量。因此，提高孕马尿中结合雌激素含量的途径之一可能是增加机体组织中游离硫酸盐的含量。

本试验给妊娠中后期的哈萨克马补喂硫酸钠、微量元素及其组合，血浆雌激素硫酸盐含量数据显示，虽然3个补喂试验组与对照组差异不显著，但是3个补喂试验组血浆中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的含量在数值上均较对照组提高。孕马尿中雌激素硫酸盐含量变化规律显示，雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的含量均在试验第30天(即妊娠第6个月)时最高，与姚军等[22]、木拉塔力·克力木等[23]研究结果一致，说明孕马在妊娠中期尿中3种雌激素硫酸盐的含量最高，随后降低。姚军等[22]研究显示，在妊娠中期孕马尿中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的含量分别为(102.3±37.7) μg/mL、(34.8±20.6) μg/mL和(15.8±10.1) μg/mL；木拉塔力·克力木等[23]的结果显示，在妊娠中期孕马尿中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的含量分别为(124.95±75.00)μg/mL、(53.76±47.97) μg/mL和(24.26±19.50) μg/mL。本试验中，补喂硫酸钠组和补喂硫酸钠和微量元素组合组孕马尿中3种雌激素硫酸盐的含量明显高于姚军等[22]、木拉塔力·克力木等[23]的研究结果，说明补喂硫酸钠、微量元素和微量元素组合能够提高孕马尿中雌激素硫酸盐的含量。对照组孕马在妊娠中期时尿中3种雌激素硫酸盐的含量与木拉塔力·克力木等[23]的研究结果基本接近，但略高于姚军等[22]的研究结果，可能与孕马的年龄、胎次等有关。

根据郭海娟[24]的研究结果，在妊娠27～29周，奥尔洛夫马平均每天的排尿量为3.84 L，新吉尔吉斯骑乘型马为4.08 L，新吉尔吉斯乳用型马为3.42 L，俄罗斯速步马为3.67 L，伊犁马为3.95 L，上述马种雌酮硫酸钠的日排出量分别为200.85、213.81、198.96、76.37、140.20 mg/d，马烯雌酮硫酸钠的日排出量分别为171.31、168.50、142.46、27.54、67.05 mg/d，17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的日排出量分别为136.03、86.11、57.21、37.21、33.22 mg/d。综合本试验结果与上述试验结果可知，在相同的妊娠阶段，不同品种、用途及饲养管理条件下，孕马尿中雌激素硫酸盐含量存在较大差异。以本试验34匹孕马日排尿量为依据，在妊娠中期，哈萨克马平均日排尿量为4.84 L。以木拉塔力·克力木等[23]的研究结果为参照，其研究得出妊娠中期哈萨克马雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的日排出量分别为604.76、260.20、117.42 mg/d，这进一步说明相同的品种在相近的妊娠阶段孕马尿中雌激素硫酸盐的含量接近，而补喂硫酸钠、硫酸钠和微量元素的组合能够提高孕马尿中雌激素硫酸盐的含量。

本试验中，补喂硫酸钠组和补喂硫酸钠和微量元素组合组孕马尿中雌激素硫酸盐的含量要高于对照组，同时也高于补喂微量元素组。此结果说明，相同的品种在同一饲养条件下，补喂硫酸钠可以提高孕马尿中雌激素硫酸盐的含量，而补喂微量元素对提高孕马尿中雌激素硫酸盐的含量无积极作用，但补喂硫酸钠和微量元素的组合能够在补喂硫酸钠的基础上进一步提高孕马尿中雌激素硫酸盐的含量。妊娠是一个复杂而多变的生理过程，需要各种营养物种共同作用来维持母畜妊娠。研究显示，微量元素除了满足母畜繁殖的需要外，还有调节繁殖激素和维持妊娠的作用[25-26]。补喂微量元素可能增加了雌酮和马烯雌酮的分泌，而补喂硫酸钠则增加了PAPS的含量，在硫酸转移酶的作用下形成雌激素硫酸盐。这可能是补喂硫酸钠组及补喂硫酸钠和微量元素组合组孕马尿中雌激素硫酸盐含量高于对照组和微量元素组的原因。

4 结 论

① 妊娠中期哈萨克母马尿中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17酮硫双氢马烯雌酮硫酸钠的含量随着妊娠的推进先升高后降低。

② 在本试验条件下，给哈萨克孕马补喂硫酸钠和微量元素的组合能够提高孕马尿中雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17中雌双氢马烯雌酮硫酸钠的含量，从而显著或极显著提高雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、17α-双氢马烯雌酮硫酸钠的日排出量。