基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

丁瑞丰，阿克旦·吾外士，李海强，潘洪生，李号宾，王冬梅，刘建

(新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/

农业部库尔勒作物有害生物综合治理野外观测站，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】目前转Bt基因棉花对棉蚜评价方法尚无明确有效的方法，室内饲养和田间调查方法的差异容易造成试验结果的差异。研究从取食Bt棉花的棉蚜入手，系统研究普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后，对其体内主要酶活性和相关生物学的影响，揭示转Bt基因棉花的种植对棉田捕食性天敌的影响作用，为转Bt基因棉花推广应用提供相应基础。【前人研究进展】 新疆作为我国最大的商品棉生产基地，2016年新疆棉花种植总面积为3 232.365万亩[1]。研究表明，种植转Bt基因棉花不但能够压低田间棉铃虫HelicocerpaarmigeraHübner等鳞翅目害虫的种群数量，且由于Bt基因拥有较小的杀虫谱，保护棉田更多的天敌昆虫，这些天敌昆虫的丰富增加了棉田的自然控害能力，减少了传统的化学防治次数，增进了棉田物种多样性，形成棉田生态系统的良性循环[2,3]。利用化学农药防治非转Bt基因棉田棉铃虫时，棉田棉蚜AphisgossypiiGlover亦得到兼治，而现今转Bt基因棉花大面积种植，棉田化学农药使用量减少，原本得到兼防的棉蚜数量呈上升趋势，现已成为棉田主要害虫之一，随着转Bt基因棉花的大面积应用和推广，棉蚜对转Bt基因棉花的适应性研究也应受到更广泛的关注[4]。棉蚜属于同翅目(Homoptera)蚜科(Aphididae)蚜属(Aphis)，其广泛分布于60°N～40°S的地域，为害时直接刺吸寄主吸取植物汁液，而且自身能够分泌蜜露影响光合作用，滋生霉污病等病菌，有文献表明其能传播花叶病等60多种病毒，寄主可达75科285种以上，属于典型的多食性害虫，为害棉花可造成每年减产15%～30%[5,6,7]；在Bt棉田的基础上通过三级营养传递关系评价转Bt基因棉花对天敌的影响尤为重要。普通草蛉Chrysopercarnea(Stephens)是脉翅目草蛉科的一种重要的捕食性天敌，其能够捕食同翅目、鞘翅目、鳞翅目、蜱螨目等多种昆虫和螨的卵和幼虫，国际上已有利用其成功防治棉铃虫和马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata(Say)等害虫，取得了较好的防治效果[8]。普通草蛉在我国大部分省区均有分布[9]，是棉田的一种重要捕食性天敌，在新疆棉田普遍发生。国外针对普通草蛉取食白粉虱TrialeurodesvaporariorumWestwood、棉蚜以及鳞翅目昆虫卵后的生长发育以及生物学特性进行了相关研究研究[10,11,12]，对其人工饲养和繁殖技术进行了探讨[13]，并针对普通草蛉的生物学特性、人工繁殖和利用技术等有较多研究，在普通草蛉成虫和卵的短期、长期贮存方面重点研究了草蛉成虫的低温贮藏方法[10,14]，同时通过释放普通草蛉卵和幼虫来防治烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)[15]棉蚜Aphisgossypii(Glover)等农田害虫[16]，取得了一定的积累。近年来我国学者针对普通草蛉的分布，发生规律、捕食对象以及其幼虫的捕食功能反应进行了较多的研究[17-21]，在Bt棉大面积种植的基础上，研究Bt棉对普通草蛉生长发育和繁殖力、捕食、Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对其酶活性的影响，积累了一定的研究成果[22,23]。【本研究切入点】鉴于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在Bt蛋白活化过程中能够起到重要作用，而蛋白酶活性的改变则与昆虫对Bt的抗性有关[24]。研究针对棉蚜取食转Bt基因棉花、普通草蛉捕食棉蚜这一食物链，研究Cry1Ac杀虫蛋白在Bt棉花、棉蚜和普通草蛉体内的传递规律，对普通草蛉捕食Bt棉田的棉蚜后其体内的主要酶活力进行测定，研究Cry1Ac对棉田主要捕食性天敌个体影响。【拟解决的关键问题】研究Cry1Ac蛋白在棉叶、棉蚜和普通草蛉的积累的传递，以及其对普通草蛉酶活力的影响，为转Bt基因棉花对棉田捕食性天敌的生物学影响提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

棉花品种：供试棉花品种为转Bt+CpTI基因棉花石远321与其亲本对照品种SGK321，棉花种植于农业部库尔勒作物有害生物综合治理野外观测站试验田(85°48′N，41°44′S)，棉田肥力中等，采用地膜栽培，播种时间为2017年4月19日，每个棉花品种种植面积为300 m2，种植密度为19.5×104株/hm2。棉花生长过程中不使用任何化学农药进行防治，其它为常规管理。

供试昆虫：普通草蛉自2012年秋季采自新疆库尔勒市包头湖农场棉田，此后用麦蛾Sitotrogacerealella(Olivier)卵和人工饲料[17]进行扩繁，饲养地点为新疆农业科学院植物保护研究所昆虫实验室。

试验所用棉蚜分别采自石远321和SGK321棉田，待田间棉蚜发生量足够大时采集回室内供试验所用。

试验开展于2017年6～8月，在普通草蛉幼虫孵化后，将单头幼虫置于直径90 mm、高15 mm的一次性塑料培养皿中在人工气候培养箱中利用棉蚜饲养，人工气候培养箱温湿度为：(25±2)℃、RH65%。

将采自石远321和SGK321棉田的棉蚜饲喂普通草蛉幼虫直至3龄。检测SGK321棉花叶片、取食SGK321棉花的棉蚜以及捕食其的普通草蛉3龄幼虫体内的杀虫蛋白含量，研究Bt杀虫蛋白在“棉叶-棉蚜-普通草蛉幼虫”的含量；对取食SGK321和石远321棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内的主要酶活性进行检测，研究转Cry1Ac蛋白通过三级营养传递对普通草蛉幼虫酶活力的影响；利用2种棉花上的棉蚜饲喂普通草蛉幼虫至其羽化，研究2种棉花上的棉蚜对普通草蛉生物学的影响。

1.2 方 法

1.2.1 室内生测

将2种棉田收集的将棉蚜连同叶片一起摘下分别置于培养皿中，保证普通草蛉幼虫有足够充足的食物，叶柄处用湿润的脱脂棉包裹以起到保湿作用。试验每处理重复3次，每个重复50头普通草蛉1龄幼虫，每8 h记录各处理的普通草蛉幼虫龄期、幼虫存活数量、蛹历期、化蛹率和羽化率等指标。

ELISA检测流程为：收集SGK321棉花的棉叶(倒二叶)、棉铃虫和棉蚜、普通草蛉3龄幼虫，样本均-20℃保存待测。取0.5 g植物组织或昆虫样本，加液氮研磨。加入PBST溶液，摇样至少2 h。在4摄氏度环境下离心5 min(12 000 r/min)，吸取上清液，转移到新的离心管中，同时加入PBST。室温下放置15～20 min，加入Enzyme conjugate，室温下放置1～2 h，PBST洗涤6～7次(250 μL/孔·次)，每次2 min，洗板时在吸水纸上轻磕。加入Substrate显色底物(100ul/孔)，室温放置30 min，在摇床上震荡使其充分反应，加入stop solution100 μL，立即在450 nm处测定OD值，根据标准蛋白测得的吸光值计算测定样本的Cry1Ac蛋白浓度。以上试验重复各10次。

1.2.2 普通草蛉幼虫主要酶活力测定

取8头普通草蛉幼虫置于玻璃匀浆器中，加入1 mL 0.15 mol/L NaCl溶液冰浴。匀浆液4℃、10 000 r/min离心15 min，取上清液作为酶提取液。每处理重复5次。

(1)类胰蛋白酶活性测定[22]

类胰蛋白酶活性用专性底物(BApNA)测定。在酶标板点样孔中分别依次加入100 μL底物、40 μL 0.1 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和10 μL酶液后立即置于酶标仪，于405 nm处开始读取吸光值，以最小时间间隔读取一个点，持续15 min。

(2)类胰凝乳蛋白酶活性测定[25]

以SAAPFpNA作为底物，将SAAPFpNA以2 mg/mL的浓度溶于0.15 mol/L NaCl溶液。在酶标板点样孔中分别依次加入45 μL底物、90 μL 0.1 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和5uL酶液后立即置于酶标仪，于405 nm处开始读取吸光值，以最小时间间隔读取一个点，持续30 min。

(3)氨肽酶活性测定[22]

以L-PNA作为底物，将L-PNA以2 mg/mL的浓度溶于甲醇。在酶标板点样孔中分别依次加入200 μL底物、95 μL 0.1 mol/L Tris-HCL缓冲液和5 uL酶液后立即置于酶标仪，于410 nm处开始读取吸光值，以最小时间间隔读取一个点，持续15 min。

1.3 数据处理

试验用EXCEL和SPSS19.0进行统计和方差分析，数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 Bt杀虫蛋白在植物、害虫和天敌体内表达

研究表明，盛蕾期棉花叶片的Bt杀虫蛋白含量为788.76 ng/g，棉蚜体内的Bt杀虫蛋白含量为2.35 ng/g，棉叶中的Bt杀虫蛋白含量约为棉蚜体内的335.6倍，在取食Bt棉上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白的表达。表1

表1 Bt杀虫蛋白在棉叶、棉蚜和普通草蛉幼虫体内的表达Table 1 The Bt protein expression in cotton leaves,A.gossypii and larva Chrysoperla carnea (ng/g)

注：表中数值为10次重复的平均值±标准误
Note：Date in this table are mean±SE of 10 replications

2.2 普通草蛉幼虫体内酶活力变化

研究表明，2个不同处理的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶之间的酶活性相近，方差分析后得知2个处理以上3种酶活性不存在显著性差异(df=8，t=1.140，P=0.287；df=8，t=0.424，P=0.682；df=8，t=0.309，P=0.765)。表2

2.3转Cry1Ac杀虫蛋白对普通草蛉间接影响

研究表明，取食2种棉花上棉蚜的普通草蛉1-3龄幼虫的存活率、幼虫各龄期的发育历期、蛹历期、化蛹率和羽化率之间均不存在显著性差异。表3

表2 不同处理后普通草蛉幼虫酶活力Table 2 Enzyme activity detection of larva of Chrysoperla carnea in different treatments(mOD/(min·mg))

注：表中数值为5次重复平均值±标准误。同一列小写字母相同表示在0.05水平差异不显著
Note：Date in this table are mean±SE of 5 replications.The same small letter indicate no significant difference in the same column(P>0.05)

表3 取食不同棉花上的棉蚜后普通草蛉幼虫生物学参数Table 3 Parameter of Chrysoperla carnea larva fed with A.gossypii on different cotton variety

注：表中数值为3次重复平均值±标准误。同一行小写字母相同表示在0.05水平差异不显著
Note：Date in this table are mean±SE of 5 replications.The same small letter indicate no significant difference in the same line(P>0.05)

3 讨 论

草蛉作为棉田生态系统中一种重要的捕食性天敌，分布较为广泛，其幼虫和成虫均具有捕食性，可取食蚜虫、叶螨以及鳞翅目的卵和低龄幼虫，捕食范围较广，具有较好的应用前景。国外研究表明，Cry1Ac杀虫蛋白并没有直接毒性，早期研究所表明的猎物对捕食性天敌的不利影响是由于Bt杀虫蛋白造成猎物营养物质下降，从而间接影响了捕食性天敌的生长发育，Bt本身对天敌并没有毒性[26-29]。

Romeis等[30]等综述了Bt作物对于田间非靶标害虫的风险，棉蚜取食Bt棉后，体内能检测到的Bt杀虫蛋白含量很低，这可能与棉蚜口针所刺探的部位是棉花的韧皮部，而此部位表达的Bt杀虫蛋白含量极低造成的。通过对取食转Bt基因棉花的棉蚜进行ELISA检测发现，棉蚜体内检测到的Bt杀虫蛋白含量最高仅为棉花植株中的1/13，甚至更低。研究表明，转Bt基因棉花对于棉蚜的生长发育和繁殖力并无显著影响，多数在棉蚜或其他非靶标昆虫体内检测到的Bt杀虫蛋白可能是由于试验时的污染或棉蓟马等微小昆虫的粪便中所含有而造成的。研究中在取食Bt棉的棉蚜体内也检测到了Bt杀虫蛋白含量，含量仅为2.35 ng/g，但这是否在试验时存在污染尚需进一步证实。

郭建英等[31]的研究表明取食转Bt基因棉花上棉蚜的丽草蛉ChrysopaformosaBrauer，其生长发育和繁殖力与对照相比并无显著差异，由此认为棉蚜的田间种群其本身的差异对于丽草蛉的影响并不显著。丁瑞丰等[23,32]的研究也表明，用取食转Bt基因棉花的棉蚜饲喂普通草蛉幼虫后，其生长发育、繁殖力和捕食功能等指标与对照相比较并不存在显著差异，表明Bt棉对于棉田草蛉类并没有负面影响。

试验所选用的Bt棉花品种为SGK321，含有Bt和豇豆胰蛋白酶(CpTI)2种基因，而试验本身是研究Bt杀虫蛋白通过三级营养传递对捕食性天敌普通草蛉的影响，但CpTI基因是否会对试验产生影响还需要进一步深入研究。试验只研究了Bt棉对1代捕食性天敌的影响，今后应分析转Bt棉对多代天敌昆虫生长发育、繁殖力、雌雄比等相关指标的影响，为转Bt基因棉花对捕食性天敌昆虫的评价提供更多参考。

4 结 论

4.1 试验在转Bt基因棉花叶片内检测到Bt杀虫蛋白(788.76 ng/g)，而取食其的棉蚜体内仅能检测到微量Bt蛋白(2.35 ng/g)，且在取食Bt棉上棉蚜的普通草蛉体内并未检测到Bt杀虫蛋白。结果表明此转Bt基因棉花能够正常表达Bt杀虫蛋白，但棉蚜体内所检测的Bt杀虫蛋白并不排除试验时可能受到污染所致，是否为取食Bt棉叶后残留还待证实。

4.2 取食SGK321棉花上草蛉幼虫体内类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的活力分别为63.84、198.38和464.48 mOD/(min·mg)，而对照分别为61.33、205.63、447.68 mOD/(min·mg)，处理与对照间并不存在显著性差异，从而为评价转Bt基因棉花中Cry1Ac蛋白对非靶标天敌的影响提供了参考。

4.3 取食SGK321棉花上棉蚜的普通草蛉1～3龄幼虫的存活率分别为86.31%、90.12%和88.84%，对照为85.82%、89.34%和88.52%，方差分析结果表明两者并不存在显著性差异；取食SGK321棉花上棉蚜的普通草蛉幼虫各龄期的发育历期和蛹历期分别为56.63、69.71、106.89和156.83 h，对照为55.76、70.38、105.48和157.35 h，其幼虫发育历期和蛹期发育时间亦不存在差异；处理化蛹率和羽化率为86.73%和92.15%，对照为83.59%和93.79%。其对草蛉的化蛹和羽化等并无无负面影响。