基于流式细胞术的15个油茶品种基因组测定研究*

杨晓兰 佟 岩 雷小林 徐林初 高立志

(1. 中国科学院昆明植物研究所，中国西南野生生物种质资源库，植物种质与基因组学中心，云南 昆明 650201；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 江西省林业科学院，江西 南昌 330032)

基因组大小或称C值，是指一个物种的配子体细胞核中染色体未进行复制时的DNA含量[1-2]，与物种的分类、进化及遗传等密切相关，是研究生物基因组多样性非常重要的特征参数[3]。迄今为止，测定基因组大小的方法主要有3种：孚耳根微显影、基因组测序法以及流式细胞术 (FCM)[4-5]。流式细胞术样品制备方便、分析快速、能在短时间内计算估测植物基因组C值，是测定C值的首选方法[6]。早在1983年Galbraith应用流式细胞术对17种植物的DNA-C值进行检测，开创了流式细胞术在植物中运用的先河[7]。目前应用流式细胞术测定C值的方法在许多植物中均已有相关报道[8-12]。

油茶 (Camilliaoleifera) 隶属于山茶属之油茶组 (Sect.Oleifera)，种子含油量较高，与油棕 (Elaeisguineensis)、油橄榄 (Oleaeuropaea) 与椰子 (Cocusnucifera) 并称为世界四大木本油料作物[13]。由油茶籽压榨而获得的茶油是一种优质食用油，因其化学成分与橄榄油相似，故有 “东方橄榄油” 之美誉[14]。茶油中富含油酸、亚油酸及亚麻酸等多种不饱和脂肪酸[15]，对降低心血管疾病、增强免疫力、降低胆固醇水平、预防与治疗高血压及预防某些癌症疾病有显著作用[16]，其余产物在农业、工业及医药中也有重要的经济价值[17-20]。迄今，我国油茶栽培面积已达370万hm2，目前中国正面临着食用油自给不足的境况，因此提高油茶产量迫在眉睫[21]。2013年，Huang等报道了应用流式细胞术测定约90余种山茶属植物的基因组大小[22]。目前国内关于流式细胞术检测油茶品种C值的研究报道甚少，本研究采用流式细胞术对15个油茶品种进行2C值的检测分析及基因组大小估测，为油茶的基因组学、细胞生物学及种质资源的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

15份油茶材料均于2018年3月中旬采自江西省林业科学院，剪取含嫩叶及嫩芽的枝条置于装有少量水的水桶中带回实验室，及时换水，备用。以基因组大小为389 Mb的水稻日本晴 (Oryzasativasubsp.japonicacv. Nipponbare) 为标样，种子由菲律宾国际水稻研究所提供，将种子置于湿润培养皿中于20 ℃光照培养箱培养7 d萌发后种植于温室备用。实验材料取自油茶与水稻日本晴植物刚抽出的嫩叶。

1.2 实验方法

1.2.1解离液筛选与荧光染料配制

流式细胞术有多种解离液及配制方法，为筛选出适用于油茶C值测定的最佳方法，本实验应用Galbraith′s (Gal)、WPB、Tris-MgCl2、Otto等4种常用解离液配方进行筛选[7,23-25]，经过预实验发现：Otto与WPB对水稻日本晴能检测出稳定峰形，而Gal与Tris-MgCl2对水稻日本晴细胞核解离效果较差，出峰不稳定，峰形较差；由于油茶中含有大量糖类、酚类等活性物质[26]，常规Gal、WPB、Tris-MgCl2、Otto等解离液对其解离效果较差，出峰效果差且杂质峰较多，而改良的Otto法对油茶的适用性较好，峰形稳定，因此选改良Otto解离液为本实验的细胞解离液。荧光染料为终浓度1 mg/mL的碘化丙啶 (Propidium iodide, PI) 溶液，避光保存。Otto解离液配方为 (改良)[25]：OttoI—100 mmol/L 柠檬酸，0.5% (体积比) Tween 20, pH 2.0～3.0，4 ℃冰箱保存 (加少量PVP)；Otto II—400 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 2.0～3.0，常温下保存 (在使用时加少量PVP)。

1.2.2细胞核悬液制备与DNA特异性染色

取少量 (约40～50 mg) 日本晴标样与油茶待测样品嫩叶于培养皿中，将其置于冰上冰浴；加入2 mL冰浴的细胞解离液OttoI；快速切碎；混匀，用300目尼龙网过滤；13 000 r/min离心30 s，弃上清，加100 μL OttoI摇匀，室温培养0.5～1 h；加1 mL Otto II，摇匀；加10 μL 10 mg/mL的核糖核酸酶A溶液 (RNase A Solution)，80 μL PI荧光染料，避光保存以备上机。

1.2.3上机检测与数据收集

将制备好的细胞核悬液用300目尼龙网过滤至5 mL聚苯乙烯无帽圆底未灭菌流式管，用美国BD公司生产的FACSCalibur流式细胞仪上机检测，设置参数，PI激发波长为488 nm，上机后收集通道FL2的荧光、检测PI发射的荧光强度，每次收集2万个细胞，每种植物取3次重复。收集数据以备分析。

1.3 数据分析

使用BD FACSCalibur自带软件Cellquest进行分析。变异系数 (CV) 控制在6%以内。内标日本晴的基因组大小为389 Mbp，根据公式 (1)：待测样本的基因组大小=标样基因组大小 ×(待测样本G0/G1峰荧光强度/标样G0/G1峰荧光强度) 计算15个待测样本的基因组大小值，2C值参照1 pg=978 Mbp计算得到[27-29]。收集数据用SPSS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

本实验采用水稻日本晴作为内标，分别测定了15个油茶材料的细胞悬浮液，部分测试结果如图1。

括号中的数字为荧光强度平均值；M1为标出的荧光强度范围。

图1水稻日本晴与部分样品样品流式细胞仪测定结果
Fig.1 Results ofO.sativaandC.oleiferausing FMC

内标水稻日本晴的DNA含量1C=0.397 5 pg，即其基因组大小为389 Mbp[30]。根据公式 (1) 计算本研究15份待测样品的基因组大小，结果见表1。

山茶属植物约有280余种[31]，目前仅有90余种的C值已被前人测定[22]。油茶作为山茶属油茶组中种子含油量较高的一个种，在我国的栽培面积最大且栽培历史最为悠久，对其进行基因组大小测定对进一步开展基因组学研究具有重要意义。从表1可知：15个油茶品种的2C值范围在13.11～19.22 pg之间，其中2C值最小的是赣兴系列的赣兴47 (13.11 pg)，最大的是赣无系列的赣无12 (19.22 pg)，与此前报道的同属植物2C值波动范围相近，除赣兴47、赣55、赣60及赣190四个品种外，其余品种的2C值均大于15.00 pg。多数品种的2C值介于15.00～18.00 pg之间，15个品种中只有赣无12的DNA-2C值大于18.00 pg。15个品种的基因组大小范围为6 411.99～9 398.58 Mbp，其中基因组大小大于7 000 Mbp的品种占总体86%。根据单因素方差结果显示15个油茶品种整体P=0.007 < 0.05，表明样本之间存在显著性差异。

表1 15个油茶品种的基因组大小Table 1 The genome size of 15 cultivars of C.oleifera

3 结论与讨论

油茶作为我国栽培历史悠久及栽培面积较大的重要油料树种，其营养价值与经济价值早已得到广泛关注，油茶研究工作者一直致力于油茶良种的选育，旨在增加油茶产量，提高茶油得率。植物DNA-C值数据库于2012年已更新至6.0版本，目前该数据库记录了8 510种植物的DNA-C值数据，包括7 542种被子植物，355种裸子植物，128种蕨类植物，232种苔藓植物及253种藻类植物[32]，该数据库中关于油茶DNA-C值记录较少。目前，国内关于油茶品种C值的研究报道甚少。本研究所选择的15个油茶品种中赣石84-8、赣永6、赣190、赣兴46、赣无11、赣无12及赣无24七个品种为江西省国审良种，这些品种适宜栽培面积较广且干仁含油率均大于45%，具有抗性强、结实早、产量高与丰产性能好等特征[33]。本研究采用基因组大小已知的水稻日本晴作为内标，水稻日本晴与待测油茶样品的DNA含量CV值在线性标尺模式下均控制在6%以内，实验结果稳定可靠。

在应用流式细胞术估测植物基因组大小的过程中，材料组织、解离液及染色试剂的选择尤为重要[6]。关于解离液的适用性，经过4种解离液的反复筛选，最终发现改良的Otto法对油茶品种的细胞解离效果更佳，能检测出较稳定的峰形。关于供试材料的选择，经嫩叶与成熟叶片对比发现嫩叶组织解离效果更佳，因此采用水稻种子萌发种植于温室7 d后的嫩叶，油茶均采用刚抽出的头3片嫩叶，每个样本剪取质量不超过50 mg。标样与待测样品的悬浮液在加入PI荧光染料避光染色10 min后再进行上机检测。

本研究采用的内标水稻日本晴的基因组大小为389 Mbp，根据公式计算得到赣55、赣60、赣71、赣190、赣833、赣无11、赣无12、赣无23、赣无24、赣石83-2、赣石83-3、赣石84-8、赣永6、赣兴46与赣兴47的基因组大小分别为7 268.70、6 970.13、7 446.85/7 085.32、8 458.23、7 705.29、9 398.58、8 193.28、7 435.63、8 596.78、8 296.73、7 920.70、8 009.80、8 682.67和6 411.99 Mbp，与前人报道的同属90余种植物的基因组大小范围相近[26]。方差分析结果表明，15个油茶品种的基因组大小存在显著性差异。油茶作为我国南方的重要木本油料树种，迄今为止国内关于油茶的C值报道甚少，在本研究中改良的油茶细胞核悬液制备为今后测定山茶属其它植物的C值提供了一定参考。

本研究以水稻日本晴为内标，应用流式细胞术测定了15个油茶品种的基因组大小，这些数据不仅可以丰富山茶属植物的C值库，而且将为油茶的基因组测序、品种改良、种质资源研究及细胞生物学研究提供参考依据。