4种品系无花果叶提取物对糖尿病小鼠降血糖作用及机制初探

张 吟， 许秋霞， 黄丹丹， 张淑芬， 马 平

无花果叶为桑科榕属植物无花果(FicuscaricaL)的叶子，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性等作用[1-7]，而无花果叶的降血糖作用是笔者关注的重点。无花果在全国各地均有栽培，福建地区的资源尤为丰富。本研究以在南方地区培植较多的紫果、日本紫果、丰产黄、美利亚为研究对象，选择目前评价降血糖及血脂作用较为经典的指标，如空腹血糖(blood glucose, GLU)、甘油三酯(triglyceride, TG)、胆固醇(total cholesterol, TC)等，比较4种品系无花果叶提取物(FicuscaricaLextracts, FCL)对1型糖尿病模型小鼠的降血糖作用，并探讨FCL在肝糖异生方面的作用机制，检测FCL对肝糖原和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)水平的影响，为无花果叶优良品种的选育提供药效学依据，并为后期的深入研究打下基础。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1动物 昆明小鼠60只，雄性，体质量22～24 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号：SYXK(沪)2012-0002，合格证号：2007000518718]。饲养条件：动物房温度为20～25 ℃，湿度为40%～70%，室内12 h 明暗切换。

1.1.2药材和主要试剂 无花果叶(产地：福建省莆田市绿阳农业开发有限公司林山无花果基地，经福建农林大学园艺学院马翠兰副教授鉴定)；FCL提取物(本课题组自制)；TG(批号：141712030)及TC测定试剂盒(批号：141612031)(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)冻干粉(美国Sigma-Aldrich公司)；小鼠G-6-Pase酶联免疫分析试剂盒(批号：201303，美国Cloud-Clone公司)；肝/肌糖原测定试剂盒(批号：20130319，南京建成生物有限公司)。

1.1.3主要仪器 全自动生化分析仪(BS-300，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；台式低速离心机(800型，上海医疗器械有限公司)；高速冷冻离心机(KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司)；微型漩涡混匀器(VXH-3，上海跃进医疗器械厂)；ACCU-CHEK®Performa Nano血糖仪及试纸条(德国罗氏诊断有限公司)。

1.2方法

1.2.1主要试剂的配制 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1 mmol/L，pH为4.0～4.5)：精密称取2.1 g柠檬酸(甲)和2.9 g柠檬酸钠(乙)，分别用灭菌注射用水溶解并定容至100 mL，配制成甲液和乙液，将甲液与乙液以57∶43的比例混合均匀配制成柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，放入4 ℃冰箱保存备用。STZ供试液：STZ用预冷4 ℃灭菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液快速溶解，现配现用，避光冰浴冷藏，10 min内注射完成。

1.2.2FCL的制备 无花果叶采摘后，用清水洗去表面的灰尘和杂质，晒干备用。称取无花果叶粉末，用5倍量的石油醚超声振荡脱脂10 min，重复脱脂3次，自然阴干备用。称取脱脂后的无花果叶粉末100 g，加入40%的乙醇，浸泡过夜，经超声波提取1 次(超声功率400 W，时间30 min，温度70 ℃)。所得提取液抽滤后置于旋转蒸发仪中浓缩，得浓缩液，经冷冻干燥后得灰黑色粉末状提取物[8]。用适量蒸馏水溶解上述提取物，配制浓度为100 mg/mL的FCL，装入棕色磨口玻璃瓶中备用。

1.2.3造模方法、分组与给药 采用一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg的方法制备1型糖尿病小鼠模型，以空腹血糖(隔夜禁食不禁水12 h)>11.1 mmol/L为造模成功标准。将造模成功的小鼠随机分为模型组、紫果组、日本紫果组、美利亚组、丰产黄组，另设正常组，共6组，每组10只。不同品系FCL组采用日剂量2 g/kg灌胃，正常组与模型组用蒸馏水灌胃。早晚各灌胃1次，体积均为0.1 mL/10 g，疗程6周。

1.2.4测定GLU，TG及TC 20:00换笼，禁食但不禁水，第2天8:00剪尾取血检测空腹GLU，干预前及干预6周后各测1次。给药6周后，1%戊巴比妥钠麻醉后摘眼球取血，室温下放置30 min后，3 500 r/min离心10 min，取血清，置生化分析仪上检测小鼠的TG及TC。

1.2.5测定肝糖原 小鼠脱臼处死，用剪刀将小鼠的腹腔打开，充分暴露腹部脏器，将整个肝脏剪下，分成3～4份(以肝叶来分)，分装到冻存管中，投入液氮罐中预保存，后转移至-80 ℃冰箱保存。检测时，取出肝脏样本，用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称质量，按样本质量(mg)∶碱液体积(μL)为1∶3的比例一起加入试管中，沸水浴煮20 min，流水冷却，制备成糖原水解液，加双蒸水制备成1%肝糖原检测液[质量(g)∶体积(mL)=1∶100]，按试剂盒说明书操作。

1.2.6测定G-6-Pase 从-80 ℃的冰箱中取出肝脏，称质量，按质量(g)∶体积(mL)为1∶4的比例加入生理盐水，在冰水浴中用匀浆器制备成20%的匀浆液，3 000 r/min离心20 min，收集上清液，按试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1不同品系FCL对糖尿病小鼠GLU，TG及TC的影响 给药6周后，与模型组比较，4种品系的FCL均能显著降低糖尿病小鼠的GLU(P<0.01)；与干预前比较，GLU也均下降(P<0.05)，其中日本紫果较干预前显著下降(P<0.01，图1)。丰产黄、紫果、日本紫果叶提取物均能显著降低糖尿病小鼠的TG水平(P<0.01)，而美利亚组虽有降低TG水平的趋势，但与模型组比较差别无统计学意义。4种品系的FCL对糖尿病小鼠的TC均没有影响(图2)。

与模型组比较，☆☆：P<0.01；与干预前血糖比较，#：P<0.05，##：P<0.01.图1 4种品系的FCL对血糖的影响Fig 1 Effect of four strains of FCL on blood glucose

2.2不同品系FCL对糖尿病小鼠肝糖原及G-6-Pase的影响 与模型组比较，日本紫果、美利亚、丰产黄叶提取物均能降低STZ诱导的糖尿病小鼠的肝糖原水平，其中丰产黄组与模型组比较，差别有统计学意义(P<0.05)；而紫果、美利亚、丰产黄叶提取物均能降低STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏G-6-Pase的水平，其中紫果、美利亚组与模型组比较有显著性差异(P<0.01，图2)。

3 讨 论

研究表明，无花果叶有较为确切的降血糖作用，无花果叶水煎剂对糖尿病大鼠或糖尿病患者均有显著的降血糖作用[9-12]。本课题组前期的研究结果与之一致[13-15]。为了克服水煎剂杂质较多、有效成分浓度较低的缺点，本课题组前期采用40%乙醇浸提与超声波辅助相结合的方法获得FCL，通过GC-MS和UHPLC/DAD联合检测，结果显示，其主要成分为芦丁、补骨脂素及佛手苷内酯，其中芦丁的含量为1.25%，总黄酮含量为9.47%[13]。

TG：甘油三酯；TC：胆固醇；G-6-Pase：葡萄糖-6-磷酸酶. A：TG；B：TC；C：肝糖原；D：G-6-Pase. 与模型组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.图2 四种品系FCL对各指标的影响Fig 2 Effect of four strains of FCL on some indexes in diabetic mice

无花果在福建地区资源较为丰富，而紫果、日本紫果、丰产黄、美利亚等为南方地区培植较多的品种，因此对4个品系无花果叶的降血糖作用进行药效学研究，对今后无花果优良品种的选育具有意义。本研究结果表明，4种品系无花果叶提取物均能显著降低1型糖尿病小鼠模型的GLU，其中丰产黄、紫果、日本紫果叶提取物还能显著降低TG水平。

为初步探讨无花果叶在肝糖异生方面的降糖机制，笔者考察了4种品系无花果叶提取物对1型糖尿病小鼠肝糖原和G-6-Pase水平的影响。结果表明，日本紫果、美利亚、丰产黄叶提取物均能降低STZ诱导的糖尿病小鼠肝糖原水平，其中丰产黄组与模型组比较有显著性差异，与文献报道一致[16-17]。笔者认为，FCL对糖尿病小鼠肝糖原含量有降低趋势，可阻止肝脏中过多的糖原转变为血糖，从而导致血糖升高，从根本上解决血糖升高问题。G-6-Pase是糖代谢中的关键酶之一，是内源性葡萄糖输出最后环节一个重要的限速酶，有直接决定糖异生作用以及机体葡萄糖稳态的重要作用，已成为研究糖尿病等代谢性疾病的重要靶点[18]。本研究结果表明，紫果、美利亚、丰产黄叶提取物能降低STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏G-6-Pase的水平，其中紫果、美利亚组与模型组比较有显著性差异。因此推测，该提取物对糖尿病小鼠的降血糖作用可能与抑制肝脏的G-6-Pase相关。

本研究以空腹血糖(隔夜禁食不禁水12 h)>11.1 mmol/L为造模成功标准。近年来，通过国内外学者的深入研究，已倾向于认定空腹血糖值>11.1 mmol/L或非空腹血糖值>16.7 mmol/L，并伴“三多一少”的症状作为实验性啮齿类大、小鼠1型糖尿病动物模型的成模标准，而以中药提取物进行降糖作用的药效学研究中，以11.1 mmol/L作为成模标准的较多[19-21]。本研究是为了在紫果、美利亚、丰产黄、日本紫果中筛选出降血糖及降TG效果较好的品种，以便进行下一步药效学和机制研究，但是只做一个剂量是本研究的不足之处，在今后对单一品种的课题试验中，将设置多个剂量进行研究。

综上所述，4种品系的FCL均可以降低糖尿病小鼠的血糖水平，但对肝糖原及G-6-Pase的影响各有不同，这是否与不同品系无花果叶所含成分不同有关，还有待今后进一步探索。本研究为今后开展FCL在肝糖异生方面的机制研究提供了线索，也为无花果的优良品种选育提供了一定的实验基础。