假交替单胞菌对EH40/B10电偶腐蚀的影响

高洁艳，吴佳佳，张盾

（1.中国科学院海洋研究所，山东 青岛 266071；2.中国科学院海洋大科学研究中心，山东 青岛266071；3.青岛国家海洋科学与技术实验室，山东 青岛 266237；4.中国科学院大学，北京 100049）

在海洋工程设施中，往往多种金属材料共同使用，电偶腐蚀难以避免[1,2]。由于海洋环境十分复杂，影响金属材料电偶腐蚀的因素多种多样，如海水的pH、温度、溶解氧、流速、压力等[2-6]。在这些影响因素中，微生物对金属材料腐蚀的影响不容忽视[7-10]。据报道，微生物腐蚀所致腐蚀损失占总腐蚀损失的20%左右[11]。因此，为减少腐蚀造成的损失，对微生物腐蚀的研究刻不容缓。目前对于微生物腐蚀的研究多集中在微生物对单一金属材料腐蚀的影响，微生物对电偶腐蚀影响的研究报道较少。Eashwar等[12]以天然海水为介质，研究了316不锈钢为阴极，镍、低碳钢、锌分别为阳极时的电偶腐蚀。结果显示，以镍为阳极时，阴极316不锈钢上存在致密生物膜，镍的腐蚀加速；但以低碳钢和锌为阳极时，以碳酸钙和氢氧化镁为主的钙质沉积物在316不锈钢上快速沉积，使得生物膜密度降低，减缓了阳极的腐蚀速率。Krogstad等[13]研究了镍铝铜合金与316L不锈钢在天然海水中的电偶腐蚀，发现电偶电流在偶对浸泡6～10天后呈线性增长，直到稳定在12 μA/cm2，他们认为这是阴极不锈钢表面的生物膜催化了阴极还原反应所导致的。Dexter等[14]以奥氏体不锈钢为阴极，分别以铜、碳钢、铝为阳极时发现，在天然海水中覆盖了生物膜的阴极比没有覆盖生物膜的阴极更加速了阳极的腐蚀。由此可见，目前微生物对电偶腐蚀影响的研究多集中在以不锈钢为阴极的研究。

随着船舶工业的高速发展，对高强度船板的需求也快速增加，EH40钢就是常用的典型船用钢之一[15]，而B10等镍铜合金因为具有良好的耐蚀性，所以是舰船上常用的管路材料[16-19]。因此，拟以 EH40钢和B10铜合金为对象，利用电化学方法、表面分析方法和环境参数测定等方法研究海洋假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.，P.sp.）对 EH40/B10 电偶腐蚀的影响，从而揭示P.sp.对EH40/B10电偶腐蚀的影响机制。

1 实验方法

1.1 实验材料准备

实验将 EH40钢和 B10铜合金都加工成尺寸为10 mm×10 mm×3 mm的样品，背面焊接铜导线后，预留出工作面（工作面积为1 cm2），其余部分全部用环氧树脂密封起来。待环氧树脂固化后，将样品依次用240#、400#、800#的砂纸打磨，之后用蒸馏水冲洗，再经无水乙醇超声清洗，冷风吹干。最后用锡纸紧密包裹后，在立式压力蒸汽灭菌锅中 121 ℃下高温高压灭菌20 min。

1.2 实验介质

实验以2216E 液体培养基（1 L海水中加入5 g胰蛋白胨、1 g酵母粉和0.01 g高磷酸铁）为介质。实验前，将配制好的2216E液体培养基在立式压力蒸汽灭菌锅中121 ℃下高温高压灭菌20 min，然后冷却至室温。在无菌对照体系中，直接以灭菌后的2216E液体培养基为实验介质；在有菌体系中，以接入假交替单胞菌的2216E液体培养基为介质。将无菌和有菌体系都置于室温环境中，并且对有菌体系每天更换1/2体积的新鲜培养基，以确保假交替单胞菌在实验期间连续稳定生长。

1.3 电化学测试

利用 Gamry3000电化学工作站对样品的电偶电位、电偶电流以及开路电位（OCP）进行测试，其中电偶电位和电偶电流的测试参照 GB/T 15748—2013《船用金属材料电偶腐蚀试验方法》[20]，电极间距为7 cm，面积比为1:1，平时用铜导线连接，测试时断开连接。测试采用三电极体系，其中EH40和B10为工作电极，石墨电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。

1.4 腐蚀形貌观察和生物膜表征

使用扫描电子显微镜（SEM，JSM-6700F）对浸泡21天后的样品进行腐蚀形貌观察。无菌体系中的样品取出后用氮气吹干，有菌体系中的样品取出后，先用体积分数为 2.5%的戊二醛溶液浸泡 1～2 h以固定微生物，之后依次使用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的无水乙醇浸泡脱水 15 min，最后进行干燥和喷金。去除腐蚀产物后的样品经无水乙醇超声清洗干燥后直接进行观察。用于生物膜表征的样品，在体积分数为 2.5%的戊二醛溶液中浸泡 1～2 h后使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行漂洗，然后浸入加有DAPI（5 mg/L）和 ConA-Texas Red（200 mg/L，与多糖结合）的PBS溶液中染色15 min。取出试样后用 0.1 mol/L碳酸氢钠溶液清洗，之后浸泡入加有FITC（0.001%，与蛋白质结合）的碳酸氢钠溶液中染色15 min。最后将试样取出用PBS漂洗去除未结合的染料，用于激光共聚焦显微镜（CLSM，LSM 710）观察。

1.5 环境参数测定

对有菌体系中的 P.sp.用 2216E固体培养基平板计数法进行定量。对两种体系的溶解氧浓度（DO）和pH分别使用溶解氧仪（Thermo Orion 5-star）和pH 计（PHS-3C）进行测定。

2 实验结果

2.1 电化学结果

由图1可以看出，无菌和有菌体系中EH40/B10电偶对在浸泡初期，电偶电位都迅速负移，后逐渐趋于稳定，最后无菌体系中电偶电位稳定在-415 mV左右，有菌体系电偶电位稳定在-480 mV左右，有菌体系的电偶电位比无菌体系负移了65 mV左右。由图2可以看出，由于电偶对在刚浸入无菌或有菌溶液的第一天反应活性较大，无菌和有菌体系中的电偶电流都随时间迅速减小。随后无菌体系中的电偶电流在10～15 μA/cm2范围内波动变化，有菌体系电偶电流则在 0.05～0.2 μA/cm2范围内波动变化，二者相差近百倍。说明EH40/B10电偶对在无菌体系中的电偶腐蚀速率远大于在有菌体系中的电偶腐蚀速率，即无菌体系中 EH40的阳极溶解速率要远大于有菌体系中EH40的阳极溶解速率。

为了进一步研究P.sp.对EH40/B10电偶腐蚀的影响，实验还分别测试了无菌和有菌条件下各金属电极的开路电位。由图3可以看出，无论EH40和B10是否偶接，无菌体系中EH40和B10的开路电位都分别比有菌体系中EH40和B10的开路电位要正。

两种体系中未偶接 EH40、B10的开路电位以及电偶电位如图4所示。可以看出，无菌体系中，电偶电位靠近EH40的自腐蚀电位；有菌体系中，电偶电位几乎与EH40的自腐蚀电位重合。说明在有菌条件下，偶对中EH40的腐蚀情况可以看作是发生了自腐蚀，因而电偶腐蚀效应不明显。

无菌和有菌体系中，偶接断开后，B10与EH40的开路电位之差（电偶腐蚀的理论驱动电压）随时间的变化如图5所示。可以看出，虽然刚浸入溶液时，可能由于电极表面反应活性高，以及有菌体系的氧含量还较高，无菌体系的电位差小于有菌体系。1天之后，无菌体系中的电位差明显大于有菌体系，无菌体系的电位差随浸泡时间延长逐渐增大，最后稳定在200 mV左右，有菌体系的电位差随时间逐渐减小，最后稳定在30 mV左右。由此可见，体系达到稳定后EH40/B10偶对在无菌体系中发生电偶腐蚀的理论驱动电压比在有菌体系大170 mV左右，说明EH40/B10偶对在无菌体系中比在有菌体系中有更大的电偶腐蚀倾向。这与图2中无菌体系中电偶电流更大的结果是一致的，说明在含有 P.sp.的有菌体系中电偶腐蚀受到了抑制。

2.2 腐蚀形貌观察

EH40分别在无菌和有菌体系中浸泡 21天去除腐蚀产物前后的SEM图如图6所示。可以看出，无菌体系中偶接和未偶接的EH40表面都覆盖了大量的腐蚀产物，而有菌体系中腐蚀产物则相对较少，覆盖了一层致密的杆状细菌，也就是 P.sp.。去除腐蚀产物后可以明显看到，无论EH40是否偶接，无菌体系中的EH40都要比有菌体系腐蚀严重。B10分别在无菌和有菌体系中浸泡21天去除腐蚀产物前后的SEM图如图7所示。可以看出，无菌体系中未偶接的B10比偶接腐蚀得更严重，而有菌体系中偶接与未偶接的B10腐蚀情况几乎相同。利用CLSM对有菌体系中浸泡21天后电极表面的生物膜表征结果如图8所示，可以看出，无论是否偶接，EH40和B10表面都覆盖了一层致密的生物膜，且EH40表面的生物膜比B10表面的生物膜相对更加致密。

2.3 环境参数分析

从图9可看出，由于P.sp.刚接入体系6 h时，还处于快速生长繁殖的阶段，所以数量较少，之后数量基本维持在105～107cfu/mL。由图10和图11可知，无菌体系中溶解氧的含量始终在7 mg/L附近波动变化，pH也始终维持在7.5左右；而有菌体系中6 h时溶解氧含量在6 mg/L左右，之后由于P.sp.大量繁殖，新陈代谢消耗氧气，体系中的溶解氧含量迅速下降，3天后基本稳定在1 mg/L左右。由此推断P.sp.可通过新陈代谢消耗氧气来抑制电偶腐蚀。同时，有菌体系中pH的变化与溶解氧含量的变化基本一致，说明P.sp.的生命活动使得溶液pH降低，偏酸性。

3 分析与讨论

将浸入无菌或有菌2216E液体培养基中的EH40和B10用铜导线连接，形成短路原电池。由图4可知，无论是在无菌体系还是有菌体系中，EH40的自腐蚀电位均低于B10，因此在EH40/B10电偶对中，EH40一方面发生自腐蚀，另一方面与B10偶接后作为阳极加速溶解，而B10作为阴极受到保护。在不考虑溶液中含有Cu2+的情况下，EH40/B10腐蚀原电池的阴、阳极的反应分别为：O2+2H2O+4e→4OH-，Fe → Fe2++ 2e。

在有菌体系中，因为每天测试结束后更换1/2体积的新鲜培养基，所以 P.sp.的数量一直维持在较高的水平，但是由于 P.sp.通过呼吸作用不断消耗体系中的氧气，致使有菌体系中溶解氧浓度远低于无菌体系中的溶解氧浓度。由此说明了相比于无菌体系，有菌体系中去极化剂氧的阴极还原反应速率受到了限制，进而抑制了阳极反应。因此，有菌体系中的电偶电流远远小于无菌体系，即有菌体系的电偶腐蚀速率远小于无菌体系。

与此同时，对于单一金属而言，当溶解氧浓度较低时，溶解氧作为去极化剂使阴极极化程度增加，从而导致金属的自腐蚀电位负移。因此有菌体系中未偶接或者偶接断开后EH40的开路电位都要比无菌体系偏负，同样有菌体系中未偶接或者偶接断开后 B10的开路电位也都要比无菌体系偏负。EH40和B10的开路电位在有菌体系中的负移程度不一样，有菌体系中偶接断开后 B10开路电位的负移程度要大于EH40。由图 5可知，有菌体系中电偶腐蚀的理论驱动电压远小于无菌体系，由此进一步说明了有菌体系的电偶腐蚀倾向远小于无菌体系。

进一步根据浸泡21天后电极的腐蚀形貌可以看出，在无菌体系中，虽然未偶接和偶接的EH40腐蚀形貌接近，但偶接B10比未偶接B10腐蚀得更轻，说明在无菌体系中偶接B10受到了阴极保护。在有菌体系中，无论是否偶接，EH40和B10表面都形成了一层致密的生物膜，并且有菌体系中EH40偶接与未偶接的腐蚀形貌比较接近，B10偶接与未偶接腐蚀形貌也比较接近。这进一步说明了在有菌体系中 EH40的电偶腐蚀效应不明显，可以看作发生自腐蚀，这与图4有菌体系中的电偶电位几乎与EH40的自腐蚀电位重合的结果一致。综上可知，含有 P.sp.的有菌体系中，电偶腐蚀受到了抑制，虽然 P.sp.的生命活动使溶液pH降低，但其对腐蚀的促进作用要小于保护性生物膜和呼吸耗氧对腐蚀的抑制作用。

4 结论

1）EH40/B10在无菌体系中的电偶腐蚀速率远大于在有菌体系，主要是因为 P.sp.呼吸作用消耗氧气以及在电极表面形成生物膜，从而抑制了电偶腐蚀。

2）在无菌体系中，偶接B10受到了阴极保护，比未偶接的B10腐蚀得轻；而在有菌体系中，是否偶接对EH40和B10的腐蚀影响不大，电偶腐蚀效应不明显。