红参、黄芪诱导的大鼠实热证模型血液内环境改变及分析

陈仙英徐莉李思敏汪琴静包洁季巾君谢冠群范永升

1.浙江中医药大学 杭州 310053 2.浙江中医药大学附属第三医院 3.浙江中医药大学附属江南医院

实热证为体内阳热之气过盛、邪热亢盛，多为内外俱实的病证，病势急骤，常见于形体壮实者[1]。《丹溪心法》曰：“气有余便是火，不足者为气虚。”[2]说明补气太过，气化过盛也会导致火热之证，产生伤津耗液的病理损害，可表现为实火或实热证[3]。文献报道，热证患者临床上多表现为代谢机能旺盛，神经、内分泌、代谢等方面呈病理性机能亢奋状态[4-5]。动物研究发现，热证模型大鼠具有肾上腺素水平升高，红细胞膜钠泵活性升高，肝细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力升高等特点[6]。

利用实验动物研究实热证机制主要有中医传统诱因模拟和西医病理复制两种造模方式[7]。中医传统诱因模拟多采用热性药干姜、附子、肉桂或者补气药党参、黄芪等造模[8-9]，西医病理复制模型多采用化学试剂如2，4-二硝基苯酚、干酵母、内毒素、二甲苯等造模[10]。虽然目前利用化学、生物等方法造成实热证模型居多，但均为单纯使用化学试剂造成的模型，与中医病证形成的病因无关，不符合中医临床实热证的特色。黄芪性甘，微温，具有补气健脾、升阳举陷、益卫固表等功效；而红参是人参的熟制品，其药性更温，具有火大、劲足、功效强的特点，两者都是补气要药，可提高内分泌和交感神经的机能活动[11]，大剂量服用易产生实热证的表型。所以本次研究主要采用了红参、黄芪模拟中医诱因联合西医病理复制的方法制备实热证大鼠模型，通过研究实热证大鼠血液内环境氧化应激状态的变化及其血液内小分子代谢物的改变，探讨实热证的病理生理机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠，体质量（160±20）g，共40只，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号 [SYXK（浙）2018-0012]。

1.2 主要试剂和药品 红参、黄芪干燥药材均购自浙江中医药大学中药饮片厂；松节油购于湖南尔康制药股份有限公司（批号：Z43020065）；色谱级甲醇、色谱级乙腈购于美国Tedia公司（批号：MS1992-801、AS1122-801）；色谱级甲酸购于阿拉丁公司（批号：F112034）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒和谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒购于南京建成生物工程公司（批号：20140117、20140115、20140116）；17-羟皮质类固醇（17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS）ELISA 检测试剂盒和促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）ELISA检测试剂盒均购自上海晶抗生物工程有限公司 [批号：JK（a）-1576、JK（a）-1552]。

1.3 主要仪器及软件 1260 HPLC-6520 Q-TOF/MS仪及配件包括G133柱温箱、G1367可温控自动进样器、G1322A在线脱气机、G1312二元高压泵、E－clipse Plus C18色谱柱均购自美国安捷伦科技有限公司；R202型旋转蒸发器购于上海申胜生物技术有限公司；Centrifuge 5417R高速冷冻离心机购于德国Eppendorf公司；多功能酶标仪为美国Thermo Scientific公司产品；超低温冰箱为日本Sanyo公司产品。SIMCA-P软件购于瑞士 Umetrics AB公司；Mass Hunter软件和Mass Profiler Professional软件均购自美国安捷伦科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 清洁级雄性Wistar大鼠40只，适应性喂养1周后按随机数字表法分为两组，即实热组和正常对照组，每组各20只。

1.4.2 中药水煎剂及大鼠模型制备 中药材红参500g、黄芪500g，以单蒸水1 000mL煎煮1h，常规煎两次，将两次水煎剂混合后，再用R202型旋转蒸发器将水煎剂浓缩至1g·mL-1。中药水煎剂大鼠灌胃量计算如下，首先以60kg体质量的成人药物使用量代入公式，然后结合大鼠的体质量用下述公式换算出大鼠每日最大中药水煎剂的灌胃量，计算公式如下，K鼠/K人为人和大鼠间按体表面积换算的等效剂量比值。

实热组次日起用中药水煎剂，4mL/d，分两次灌胃，共1周，背部皮下注射松节油（致热物）2mL使其发热；正常对照组则每只予等量的0.9%氯化钠溶液，分两次灌胃，共1周。

1.4.3 检测指标及方法

1.4.3.1 大鼠基础代谢数据的测定 各组大鼠随机选取10只进行数据测定。从实验开始起至灌胃结束（为期7d），每日灌胃前测量，并记录两组大鼠饮水瓶重量，计算各组大鼠日均饮水量。计算公式如下：

皮下注射松节油之后2d，每日上午8点采用温度计插入肛门内测量安静状态下的大鼠肛温。建模成功标准为饮水量增多，肛温达39℃以上并持续2d；血清内TSH及17-OHCS含量均升高。建模过程中无动物损耗。

1.4.3.2 血清中TSH及17-OHCS含量的测定 造模结束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉取血5～10mL，平均分装于EDTA抗凝试管和促凝管，EDTA抗凝试管于2 000r/min，离心15min，分离血浆；促凝管静置约1h后，于3 000r/min，离心10min，分离血清。血浆及血清样本分别分装于1.5mL的EP管内，标记后置于-80℃冰箱保存备用。采用ELISA检测血清中TSH及17-OHCS含量，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.4.3.3 血浆中MDA、GSH、T-AOC的水平测定 各组大鼠随机选取10只进行数据测定。采用硫代巴比妥法检测血浆中MDA的水平，分光光度计法检测血浆中GSH的水平，化学比色法检测血浆中T-AOC的水平，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.4.3.4 液相色谱-质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）鉴定血清中的小分子代谢物 室温下解冻所采集血清样品，取150μL置于离心管中，加入450μL乙腈沉淀蛋白，涡旋30s，静置10min后，4℃下 12 000r/min离心 10min，取 300μL上清液以去离子水1:1稀释，稀释后的600μL血清样品用0.22μm尼龙膜过滤，弃去初始滤液，用于LCMS分析。色谱条件：流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱，起始梯度为20%B并维持2min，在10min内增至65%B，12min内增至85%B，然后在2min内升至98%B并维持2min，后运行时间为5min，流速为0.2mL/min。设置柱温箱温度为35℃，自动进样器温度为5℃，进样量为5μL。质谱条件：分别使用ESI正、负离子模式采集数据。数据采集质荷比范围为：50～1 000m/z，干燥气为 N2，干燥气温度为350℃，正、负离子模式毛细管电压分别为4 000V、3 500V，碎裂电压为180V，锥孔电压分别为60V，雾化器压力为275.8kPa。使用Centroid模式保存质谱数据，数据采集速率为2spectrum/s。数据采集过程中参比液实时监测校准质谱系统。二级质谱数据采集时，碰撞能设置为20eV，二级质谱采集速率为2spectrum/s。

使用Mass Profiler软件，对实热组和正常对照组原始数据进行预处理，并在Excel 2010软件中进行归一化及后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量保留时间-质荷比（mass-to-charge ratio，rt-m/z）、分子质量、观察量（样本）和峰强。本项目样本在该模式下共得到1 069个features。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件（v 13.0）进行无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有监督的偏最小二乘判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）对数据进行模式识别。并进一步采用正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）进行建模分析。采用OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，并结合t检验的P值来寻找差异性表达代谢物，要求VIP值＞1，P＜0.05。差异性代谢物的定性方法为：搜索Metlin在线数据库，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量（mass）。将得到的总差异物质输入到Metabo Analyst 3.0中，获得这些差异物质所在的代谢通路。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，均值间差异比较用独立样本t检验；计数资料组间比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的饮水量、肛温水平及血清内TSH及17-OHCS含量比较 结果显示，实热组大鼠在灌胃期间饮水量增多，每日饮水量均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。皮下注射松节油之后，实热组大鼠肛温达39℃以上并持续2d，均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。实热组大鼠血清内TSH及17-OHCS含量均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。以上指标均符合实热证动物模型的判定标准，表明该模型建立成功。

表1 两组大鼠日均饮水量比较（±s，g）Tab.1 Comparison of daily drinking water in two groups(±s,g)

表1 两组大鼠日均饮水量比较（±s，g）Tab.1 Comparison of daily drinking water in two groups(±s,g)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05.

组别n 日均饮水量实热组正常对照组10 10 18.64±3.61*14.48±3.18

表2 两组大鼠前两天日均肛温比较（±s，℃）Tab.2 Comparison of daily average anus temperature in two groups(±s,℃)

表2 两组大鼠前两天日均肛温比较（±s，℃）Tab.2 Comparison of daily average anus temperature in two groups(±s,℃)

注：与正常对照组同时点比较，**P＜0.01。Note:Compared with control group at the same time,**P＜0.01.

组别 n 第1天日均肛温 第2天日均肛温实热组正常对照组10 10 39.65±0.59**39.00±0.20 39.67±0.59**39.01±0.20

表 3 两组大鼠血清 TSH、17-OHCS 含量比较（±s，mU·L-1）Tab.3 Comparison of serum levels of TSH,17-OHCS in two groups(±s,mU·L-1)

表 3 两组大鼠血清 TSH、17-OHCS 含量比较（±s，mU·L-1）Tab.3 Comparison of serum levels of TSH,17-OHCS in two groups(±s,mU·L-1)

注：与正常对照组比较，**P＜0.01。Note:Compared with control group,**P＜0.01.

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2.2 两组大鼠的血浆中MDA、GSH、T-AOC的水平比较 与正常对照组比较，实热组大鼠血浆中MDA、GSH、T-AOC 水平明显升高（P＜0.05)，差异均有统计学意义。见表4。

表4 两组大鼠血浆中MDA、GSH、T-AOC水平比较（±s）Tab.4 Comparison of concentration level of MDA,GSH and T-AOC in two groups(±s)

表4 两组大鼠血浆中MDA、GSH、T-AOC水平比较（±s）Tab.4 Comparison of concentration level of MDA,GSH and T-AOC in two groups(±s)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05.

组别 n T-AOC（U·mL-1）实热组正常对照组10 10 3.89±2.44*1.57±1.50 MDA（nmol·L-1） GSH（μmol·L-1）3.03±0.87*1.48±0.33 21.82±2.72*4.75±1.50

2.3 两组大鼠血清代谢物典型LC-MS总离子流色谱图 图1为质控品多次重复进样所得总离子流（total ion current，TIC）重叠图。初步观察发现仪器的保留时间重现性非常好，仪器稳定，这些结果表明质谱系统有较好的稳定性和重现性。

2.4 血清样品的LC-MS分析及差异代谢物的挖掘鉴定 正常对照组选取16只，实热组选取6只进行测定。为了判别两组之间是否具有差异，本研究采用PCA建模方法对样本进行分析。对实热组和正常对照组进行PCA获得PCA得分图，该模式下共获得3个主成分，累积R2X=0.357，Q2=0.064。见图2。采用监督性的多维统计方法即PLS-DA对两组样本进行分析。其模型质量参数为，R2X=0.327，R2Y=0.998，Q2=0.945。从模型的参数来看，寻找差异物质是可靠的，不存在“过拟合”现象。见图3。进一步采用OPLS-DA进行建模分析，结果该模式下得到2个主成分和1个正交成分，R2X=0.327，R2Y=0.998，Q2=0.8。见图 4。结果显示，与正常对照组大鼠比较，实热组大鼠血清中溶血卵磷脂、二十碳五烯酸、皮甾酮等物质含量降低（P＜0.01），棕榈酸、鞘氨醇含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表5。

图1 两组大鼠样本总离子流重叠图Fig.1 Total ions chromatogram of sample of two groups

图2 两组大鼠PCA得分Fig.2 PCA scores of two groups

图3 两组大鼠PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA scores of two groups

图4 两组大鼠OPLS-DA得分Fig.4 OPLS-DA scores of two groups

表5 差异代谢物鉴别结果Tab.5 Differential metabolite identification results

3 讨论

实热证是临床上常见的证型。我国最早关于热证的描述记载于《黄帝内经》中：“人之伤于寒也，则为病热。”《千金方》《景岳全书》《医宗金鉴》等著作中也记载着关于脏腑的热证，如肺实热、胃实热、肠道湿热证等。近年来，人们已经开始运用现代科学方法来研究实热证，对实热证有了新的认识[12]。

传统医学认为人体内外都是以阴阳平衡的形式存在，美国Brunswick研究中心在比较东西方文化中提出的阴阳学说与抗氧化的关系时，认为过氧化及抗氧化平衡状态与体内的阴阳制约过程相关[13]。而热证则是由于各种原因使人体内的阴阳平衡遭到破坏而出现的一些症状。因此，机体所表现的“火热”的生理反应可能对应机体内的氧化应激过程[14]。MDA是自由基作用于脂质发生的过氧化反应产物[15]，当MDA水平升高时，提示产生的脂质氧化终产物增加，过氧化与抗氧化失衡，即发生氧化应激反应，可导致机体相关疾病发生。GSH是一种自由基清除剂，参与体内糖代谢及三羧酸循环，通过激活多种酶，促进蛋白质、糖及脂肪代谢[16]。机体内存在多种抗氧化物，清除体内产生的各种活性氧，从而阻止氧化应激的产生，T-AOC可以说是一个体系内的各种抗氧化大分子、小分子和酶的总水平[17]。临床研究表明，实热“上火”人群的血浆中MDA、GSH、T-AOC水平明显升高[14]。本研究发现，实热证动物模型与临床实热“上火”人群血浆中MDA、GSH、T-AOC水平变化一致，均明显升高，说明实热“上火”与氧化应激反应密切相关，在实热“上火”状态时，体内产生脂质过氧化物MDA较正常时增加，提示已经发生过氧化反应，但同时GSH、T-AOC的升高说明机体动员自身抗氧化能力，试图恢复机体的氧化平衡状态。

血清内氧化应激水平的异常是否会引起血清代谢物的变化，本研究进一步探讨了这个问题。本研究显示模型大鼠体内溶血卵磷脂、皮甾酮和二十碳五烯酸等物质降低，同时导致棕榈酸、鞘氨醇升高，说明热证大鼠血清中的脂质代谢发生显著变化，导致脂代谢和甾体激素生物合成异常。溶血卵磷脂,亦称溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine），是卵磷脂被磷脂酶A水解生成的一种化合物[18]。鞘氨醇（sphingosine）是一种含有不饱和烃基链的十八碳氨基醇，为细胞膜组成成分之一，两者都属于磷脂质的一种，在细胞识别和信号转导及调节细胞代谢上具有重要作用，与炎症、免疫、过敏及心血管疾病等重要病理过程有关[19]。二十碳五烯酸是人体常用的几种Ω-3脂肪酸之一。研究发现不饱和脂肪酸能调节血脂，能有效地控制人体血脂的浓度，增加二十碳五烯酸的吸收，已被证实有利于治疗冠状动脉心脏病、高血压，并对治疗由自身免疫缺陷引起的炎症有效[20-21]。皮甾酮（cortexolone）又名可托多松，属于类固醇激素（即甾体激素），与可的松或氢化可的松这些类固醇激素类似,具有优良的抗炎、抗过敏和免疫抑制作用[22]，皮甾酮的显著降低提示体内抑制炎症反应的能力被削弱。

知柏地黄汤是临床使用经典的滋阴降火方药，笔者前期研究中检测知柏地黄汤对大鼠内环境的改变，发现知柏地黄汤造模的大鼠血液中棕榈酸含量降低，一系列溶血性磷脂含量升高[23]。本文中红参、黄芪诱导的大鼠实热证模型血液中棕榈酸含量升高，同时也伴有一系列溶血性磷脂含量降低。因此，血液中棕榈酸和溶血性磷脂在实热证发生过程的作用机制值得进一步探讨。

氧化应激水平的增加与动脉粥样硬化中的内皮功能受损有关，并在心血管疾病进程中起着重要作用。脂质代谢的稳定在维持能量、免疫稳态中发挥重要作用，不饱和脂肪酸能降低胆固醇、甘油三酯水平，抑制炎性细胞因子诱导的内皮活化，减少内皮细胞迁移和增殖[24]，对血小板功能和动脉血栓有明显影响。增加不饱和脂肪酸的含量可改善脂代谢紊乱、炎症及氧化应激状态，同时可改善内皮细胞功能[25]。本研究结果显示实热组大鼠血清氧化应激水平升高，不饱和脂肪酸二十碳五烯酸的含量显著降低，提示热证可能会加剧消耗不饱和脂肪酸，进而可能会增加人体氧化应激的程度，引起心血管系统的炎症反应。以上提示热性药的长期使用或者长期处于实热的状态有增加心血管疾病的风险，临床使用热性药进行治疗时，要慎重考虑到时间及剂量的准确性。

综上，实热证可能跟机体的神经内分泌、能量代谢等有很大的关联。本研究中采用了红参、黄芪模拟中医诱因叠加西医病理复制的方法制备了实热证大鼠模型。虽然从客观指标来说该造模方法大体符合中医实热证的临床表现，但是尚不能充分体现动物模型与原病证的相似性和典型性，与中医临床实热证形成的病因还是存在着一定的差别。理想的中医热证模型必须符合中医的特色，因此病证结合的造模方法是复制中医证候动物模型的必经之路。在实热证评价指标方面，研究指标虽然很多，但只能说明单一方面的问题，多种指标的内在联系及如何与整体结合起来观察还有待进一步探究。