海南岛泛树蛙属(两栖纲：无尾目：树蛙科)物种的 形态特征鉴定及其多样性研究

刘秋成， 翟晓飞， 王同亮， 汪继超

(海南师范大学生命科学学院，热带岛屿生态学教育部重点实验室，海口571158)

泛树蛙属Polypedates隶属树蛙科Rhacophoridae，目前该属共24个物种(Frost，2017)。国外对泛树蛙属物种的研究发现，该属物种的分类及系统发生关系较为复杂，同时也存在诸多争议(Brownetal.，2010；Sheridanetal.，2010；Riyantoetal.，2011；Kuraishietal.，2012)。在国内，Pan等(2013)在前人研究(Lietal.，2008，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2012)的基础上，基于分子系统发育关系重新评估了P.leucomystax复合体的分类，发现其在东南亚地区有5个物种，其中，中国分布有斑腿泛树蛙P.megacephalus、布氏泛树蛙P.braueri、无声囊泛树蛙P.mutus和凹顶泛树蛙P.impresus4个物种，模式产地分别是中国香港(Hallowell，1861)、中国台湾(Vogt，1911)、缅甸N’Chang Yang(Smith，1940)和中国云南省普洱市(杨大同，饶定齐，2008)。这4个物种在中国的分布情况详见表1(中国两栖类，2018)。然而，泛树蛙属物种间的形态差异较小，繁殖模式和栖息地环境相似，其分类及分布目前仍然存在较大争议。

表1 泛树蛙属物种在中国的分布Table 1 Distribution of Polypedates species in China

泛树蛙属物种在海南岛也有分布，且体色变异较大，以往基于体色及背部有无“X”形斑等特征较难准确区分该属物种(史海涛等，2011)。由于海南岛地形和植被类型较为复杂，尚无在全岛范围内对泛树蛙属物种的系统调查，其物种多样性及是否存在隐存种均不清楚。本研究基于全岛范围内的系统样本采集，通过分子系统学分析，构建海南岛泛树蛙属物种的分子系统发育关系，结合形态特征比较，探究海南岛该属物种多样性与分布格局，同时通过不同物种间形态特征的详细对比，总结可用于分类鉴定的典型形态特征，为其他地区该属物种的分类鉴定提供依据，也为进一步开展该类群物种的景观遗传学和生物地理学研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

研究地点位于中国海南岛(108°36′45″～111°16′22″E，18°9′33″～20°9′42″N)，全岛面积33 907 km2，属低纬度热带季风气候(王宝灿，2006)。2015年7月—2017年7月，根据海南岛地形及泛树蛙属的生境类型，在全岛范围内选取了30个采样点(表2，图1)，共采集256号标本。采用GPS记录采集点经度、纬度、海拔等信息，并对生境及形态拍照。

表2 泛树蛙属30个种群采集样点Table 2 Sampling localities of 30 populations of Polypedates

图1 海南岛泛树蛙属物种调查取样点
Fig. 1 The sampling points ofPolypedatesspecies on Hainan Island

1.2 形态鉴定与数据测量

参考《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》(费梁等，2012)对采集的所有泛树蛙标本进行初步分类与鉴定，然后随机选择体长超过《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》中描述的斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙成体体长最小值的115号标本测量了形态指标(表3)。电子天平(SI234，丹佛仪器(北京)有限公司，精度0.1 mg)称量体质量；数显游标卡尺(10810206，广州百威狮工具有限公司，精度0.01 mm)测量体长、头长、头宽、吻长、鼻间距、眼间距、上眼睑宽、眼径、鼓膜、前臂及手长、前臂宽、后肢全长、胫长、胫宽、附足长与足长等形态指标。数据以平均值±标准差表示。

1.3 系统发生关系构建

参考Kuraishi等(2013)和Pan等(2013)对东南亚地区泛树蛙属系统发育关系的研究，选取线粒体12SrRNA、16SrRNA基因片段作为遗传标记对海南岛泛树蛙属标本进行基因组DNA提取及目的基因扩增。扩增所用的引物序列为FS01：5’-AACGCTAAGATGAACCCTAAAAGTTCT-3’， Rend：5’-GACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3’。以P.india、P.malaysia和P. sp.malaysia为外群，在Pan等(2013)研究结果的基础上，加入通过形态特征初步鉴定的斑腿泛树蛙(11个地理种群)和无声囊泛树蛙(4个地理种群)标本的序列，采用贝叶斯推断法构建系统发生关系，以佐证形态特征鉴定的结果。

2 结果

2.1 形态特征分析

对采集的标本逐一进行详细的形态特征比较与分析，发现海南岛上仅分布斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙。斑腿泛树蛙在全岛范围内均有分布，而无声囊泛树蛙仅分布在海南岛的吊罗山、白石岭、五指山和尖峰岭等中南部山区。斑腿泛树蛙分布的最低海拔为4.9 m，海拔200 m以上为斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙的分布重叠区域。基于以下几个关键的形态特征能将两者进行准确分类：在体型方面，斑腿泛树蛙身体宽而扁平，成体雄蛙体长50.28 mm±4.23 mm(n=59)，成体雌蛙体长69.36 mm±4.09 mm(n=27)，而无声囊泛树蛙身体窄长而扁平，成体雄蛙体长60.86 mm±4.51 mm(n=27)，成体雌蛙体长84.82 mm±3.27 mm(n=2)(表3)；在体侧及其后半部斑纹方面：斑腿泛树蛙体侧无斑点，后半部有网纹(图2：a)，而无声囊泛树蛙体侧有大的黑褐色点斑缀成连续状，体侧后半部无网纹(图2：c)；在股后部斑点方面：斑腿泛树蛙股后部斑点小而密集(图2：b)，无声囊泛树蛙则大而稀疏(图2：d)。此外，斑腿泛树蛙后肢粗壮，胫跗关节前伸达眼与鼻孔之间，而无声囊泛树蛙后肢细长，胫跗关节前伸达吻端或鼻孔。

2.2 海南岛泛树蛙与东南亚其他泛树蛙的系统发育关系

基于贝叶斯法构建的系统发育关系与Kuraishi等(2013)、Pan等(2013)的拓扑结构基本一致，明显分成了5个支系(Clade A～E)，且每个支系后验概率较高(≥0.97)(图3)。Clade A包含斑腿泛树蛙模式产地中国香港的标本序列，还有广西、广东及越南，泰国的斑腿泛树蛙标本序列，这些序列和所有本研究基于形态特征初步鉴定出来的海南岛斑腿泛树蛙标本序列一起构成了Clade A，与来自菲律宾、印度尼西亚和缅甸的P.leucomystax(Clade B)构成了姐妹群。Clade A与Clade B一起与Clade C构成姐妹群，Clade C包含来自老挝和中国云南的凹顶泛树蛙。Clade D包括来自重庆、云南和广西的布氏泛树蛙，与前面4支构成姐妹群。Clade E包括中国广西和越南的无声囊泛树蛙以及本研究基于形态特征鉴定的海南岛的无声囊泛树蛙种群标本序列。通过形态特征比较和分子生物学数据分析，没有发现隐存种。

表3 海南岛泛树蛙属物种形态学特征Table 3 Morphological characteristics of Polypedates on Hainan Island

图2 斑腿泛树蛙侧面观(a)和股后部(b)， 无声囊泛树蛙侧面观(c)和股后部(d)Fig. 2 The side view (a) and posterior portion (b) of Polypedates megacephalus and the side view (c) and posterior portion (d) of P.mutus

图3 基于线粒体12S rRNA、16S rRNA基因构建的泛树蛙属系统发育关系树Fig. 3 Phylogenetic tree of Polypedates based on the mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene

3 讨论

此前对海南岛泛树蛙属物种的分子生物学研究仅基于海南岛局部区域采集的少量标本，并未对全岛进行大范围的采样，由于种间特征相似，仅依靠形态或分子生物学手段得出的结果缺乏相互的佐证。因此，对海南岛泛树蛙属物种的分类与分布格局一直存在争议(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。本研究通过系统调查取样，把在海南岛采集的所有泛树蛙属物种样本的线粒体12SrRNA和16SrRNA基因序列与P.leucomystax复合体已知序列构建系统发育树，发现海南岛所有样本只分布在2个支系上，分别是斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙。因此，确认了海南岛仅分布有斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙。斑腿泛树蛙在全岛均有分布，而无声囊泛树蛙仅分布在海南岛中南部山区。斑腿泛树蛙作为海南岛广泛分布的物种，其种群的遗传结构特点及其可能存在的遗传分化值得进一步研究。

斑腿泛树蛙早期被认为是P.leucomystax的亚种(Stejneger，1925；Pope，1931；Inger，1966)，中国学者认为是P.leucomystax的同物异名(Liu，1950；刘承钊，胡淑琴，1961)。Matsui等(1986)通过对分布在中国台湾和婆罗洲的种群进行比较分析，认为斑腿泛树蛙不是P.leucomystax的同物异名。随后，中国的一些分类学者也认为中国大陆的种群都是斑腿泛树蛙(Zhao & Adler，1993；费梁，1999；费梁等，2005，2009)。Liu等(1960)在云南河口采到背部有条纹却没有声囊的泛树蛙属的物种标本，认为该物种为无声囊泛树蛙。Inger等(1999)也认为华南地区没有声囊的标本是无声囊泛树蛙。杨大同和饶定齐(2008)于云南省普洱市发现了一泛树蛙属的新种，并将其命名为凹顶泛树蛙，后来该物种的有效性也得到了分子生物学的验证(Panetal.，2013)。Kuraishi等(2011)对斑腿泛树蛙模式产地香港种群与台湾种群的标本在分子生物学、鸣声特征以及形态学方面做了比较研究，认为这2个地理种群存在明显差异，明确了台湾种群是布氏泛树蛙而不是斑腿泛树蛙。随后一些学者通过进一步的分子系统学研究，发现中国分布的泛树蛙为多个物种(Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。本研究通过分子生物学手段，验证了对海南岛泛树蛙属物种鉴定所参考形态特征的准确性，发现以往采用物种的体色和体背“X”形斑等特征不能准确区分海南岛的泛树蛙属物种。本研究通过详细的标本对比，认为体型、体侧斑点及其后半部网纹、股后部斑点和胫跗关节前伸至眼/鼻/吻端的位置等特征可作为准确鉴别斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙的稳定且典型的形态特征。运用该形态特征鉴定的结果与分子数据鉴定结果一致，这些特征可为其他分布区对这2个物种的分类鉴定提供参考。

斑腿泛树蛙为全岛广泛分布的物种，种群数量相对较多，但无声囊泛树蛙仅分布于海南岛中南部山区，分布区狭窄，种群数量相对较少，其栖息地为生境保存相对完好的次生林和原始雨林区，作为一个重要的环境指示物种，应加大保护力度，降低人为干扰和栖息地破坏。

致谢：海南师范大学硕士研究生陈一帆及本科生张豪在野外采样过程中给予帮助；北京林业大学博士研究生黄勇杰在分子生物学数据处理中给予指导和帮助，在此一并表示感谢。