流式细胞术与免疫组织化学技术在淋巴结增生性疾病中的比较研究

薛晓伟 李星奇 王德田*

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是对快速直线流动状态中的单个细胞进行分析的技术，其可快速、准确和客观地检测细胞的多项物理及生物学特性，并可进行定量分析，同时还可对特定细胞群体加以分选[1]。FCM虽然在我国起步较晚，但近年来发展迅速，已成为研究细胞生物学的重要工具[2-4]。FCM在血液病学诊断方面具有重要的作用，尤其是流式免疫分型的应用使白血病和淋巴瘤的诊断变得快捷和容易。对于病理科而言，在淋巴瘤的诊断中免疫组织化学技术起着举足轻重的作用，而引入FCM是对形态诊断的提示和补充。本研究旨在对FCM与免疫组织化学技术在淋巴结增生性疾病中的作用进行探讨。

1 材料与方法

1.1 标本采集

收集2016年12月至2017年5月北京协和医院46例患者，其中40例为门诊淋巴结肿大患者，6例为住院发热待查患者；男性24例，女性22例；年龄14～81岁，平均年龄(37.6±3.4)岁。共采集标本46例，分别是锁骨上淋巴结20例，腹股沟淋巴结16例，腋窝淋巴结10例，所有经手术切除淋巴结均为进行固定，经多点取材进行流式检测，剩余组织固定脱水，进行形态学检测。所有患者均参照2008年世界卫生组织(WHO)造血与淋巴组织肿瘤分类标准诊断[5]。

1.2 仪器与试剂

(1)仪器。VIP6型全自动组织脱水机(日本樱花公司)；RM2235型轮转式石蜡切片机(德国徕卡公司)；CV5030型全自动HE染色封片机(德国徕卡公司)；FACSAria型流式细胞仪(美国BD公司)，流式分析采用FACSDiva软件；BOND型全自动免疫组织化学仪(德国徕卡公司)。

(2)试剂。流式细胞法用单克隆抗体和配套试剂(美国BD公司)；免疫组织化学法用单克隆抗体和配套试剂(德国徕卡公司)。

1.3 流式细胞标本制备及检测

(1)标本的保存。淋巴结标本置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，4 ℃，保存48 h内处理；或者置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)，即刻上机使用。

(2)单细胞悬液制备。眼科剪或手术刀柄分离组织，18 G的细针头反复吸取，滤网过滤，PBS洗涤3次，悬浮于0.5～1 ml洗液备用。

(3)细胞计数。调整标记105细胞即可，细胞浓度=细胞计数4个大格细胞数÷4×稀释倍数×104/ml。

(4)标记。在制备好的单细胞悬液中分别加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、(peridininchlorophyll-protein complex，PerCP)和(allophycocyanin，APC)的4种荧光素标记的单抗[6]避光孵育20 min。

(5)洗涤。加入1 ml的PBS，以300 g离心洗涤5 min。

(6)上机检测。弃去上清，加入PBS 200～500 μl，上机检测。如不能及时上机，则加入同体积的1%多聚甲醛，混匀后置于4 ℃冰箱内保存，一般≤24 h。在标记Kappa和lambda抗体时，为避免Fc受体的非特异性结合，要先用PBS洗涤待测标本3次，离心后再标记。

(7)参数分析。采用双变量散点图的方式对结果进行输出。双变量散点图包括散射光和荧光染色，即在每个双变量散点图中，设定4个区域：细胞未结合任何抗体(双阴性)、仅结合一种抗体或结合另一种抗体(单阳性)和结合两种抗体(双阳性)的区域。

1.4 组织学检测方法

淋巴结组织经10%甲醛固定后，全自动组织脱水机进行脱水处理，包埋、制片及HE染后，镜下诊断，对于怀疑淋巴瘤的切片进行免疫组组化学染色分析。其中，T淋巴细胞及亚群的表面标记物CD5、CD10和CD23均为细胞膜阳性表达。

1.5 淋巴细胞系别和分化阶段的判定

CD3、CD5主要表达T细胞，CD4主要表达于辅助和(或)诱导T细胞，CD7表达于大部分T细胞和部分NK细胞，CD8表达于抑制和(或)细胞毒性T细胞，B细胞表达CD10、CD19、CD20、cCD22及CD79α，CD56在NK细胞淋巴瘤中均高表达，CD5、CD3、CD19及CD20规则地在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)各亚型淋巴瘤细胞中表达。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件对数据结果进行统计，两组之间的差异进行卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞检测结果

FCM技术共检测标本46例，其中筛选出B系淋巴瘤25例，基本正常标本21例。

2.2 组织学检测结果

经形态学分析，46例标本中有15例为淋巴结反应增生性疾病，1例为淋巴结结核，5例为转移癌，25例为B系淋巴瘤。B系淋巴瘤中有14例弥漫大B淋巴瘤，6例滤泡性淋巴瘤，5例套细胞淋巴瘤。

表1 两种技术检测CD5、CD10和CD23抗体表达的关系(例)

2.3 FCM与免疫组织化学技术一致性对比

(1)在46例标本中，进行免疫组织化学技术检测并与FCM检测有重合的标本有40例，其中，两种技术检测重合的抗体主要涉及CD5、CD10和CD23，两组间无统计学差异(x2=0.05，x2=0.05，x2=0.00；P＞0.05)，见表1。

(2)两种技术检测重合的抗体阳性一致性比对抗体的表达如图1、图2所示。

图1 免疫组化法检测CD5示图

图2 流式细胞术检测CD5示图

3 讨论

FCM技术和免疫组织化学技术的基本原理都是抗原—抗体反应，但是检测的对象不同。免疫组织化学检测对象往往是组织切片，而流式的检测对象是活体的细胞。免疫组织化学技术需要在抗原—抗体结合后，经过显色反应，病理医师结合镜下结构对显色的结果进行判读。而流式细胞仪利用鞘液和气体压力将样本细胞依次输送到测量区，并在细胞受激光激发后，收集光信号，并将光信号转换为电子信号，量化后传递给计算机。由于流式细胞仪的对象无需固定、切片等步骤，因此较传统的免疫组织化学的方法更加快捷。但是流式检测往往在HE染色之前，存在一定的盲目性，因此初筛方案中抗体的确定就显得尤为重要。

在本研究中采用的流式抗体初筛方案中，确定B细胞克隆性通常是诊断B细胞淋巴瘤的关键，因为区分肿瘤性过程和反应性过程最重要的特征就是前者的克隆性，几乎所有的肿瘤性疾病均为单克隆，而大多数良性反应性疾病则是多克隆性[7]。确定克隆性的标准是直接或间接，对于B细胞淋巴瘤而言，其免疫球蛋白轻链限制性是其克隆性的最直接和可靠的证据。而FCM通过检测B细胞Kappa和lambda轻链比率进而判断是否呈轻链限制性是确定B细胞克隆性最方便和有效的方法。对非肿瘤性样本的研究发现，B细胞Kappa和lambda轻链比率通常在1∶1～2∶1范围内[8-11]。B细胞淋巴瘤表达单克隆轻链，这一比率通常增大(Kappa阳性淋巴瘤)或减小(lambda阳性淋巴瘤)。一旦确定为B系淋巴瘤，可根据CD5、CD23、FMC-7和CD10的表达将淋巴瘤进行分类[12-13]。在此类初筛方案中，虽然单克隆性是诊断B细胞淋巴瘤的必要条件，但应注意的是，单克隆不一定是B细胞淋巴瘤，如生发中心B细胞增生、炎症及病毒感染等导致Kappa/lambda比值异常的病变；与此相反，在同一标本中如果良性反应性B细胞较多，则实际检测得出的Kappa和lambda比率在上述正常范围内，可能会掩盖肿瘤细胞而出现假阴性。然而，对于上述两种情况，可以从其他诊断线索中加以明确，如利用前向散射(forward scatter，FSC)及侧向散射(side scatter，SSC)提供的关于细胞大小和胞浆、胞核的复杂性信息，或其他免疫标志表达水平的改变所提供的信息，以将肿瘤细胞群与良性细胞群区分开来，尽可能的避免正常细胞对克隆性分析结果若存在Kappa和lambda双阴性的情况，还可能是部分肿瘤如B-淋母，本身表面免疫球蛋白轻链表达缺乏或减弱；或者轻链确实存在而流式测阴性的淋巴瘤，如弥漫大B等[14-15]。

但是，FCM缺乏形态学的相关证据，如经典型霍奇金淋巴瘤特征性RS细胞等无法获得镜下资料。此外，由于取材受限，FCM有可能忽略病变部位造成假阴性的情况出现，在本次实验中就出现了两次假阴性的结果，虽然对诊断未造成影响，但这种情况还需要以后的流式操作中加以重视。本研究由于事先尚无相关的病理诊断信息，因此入组的标本量少，缺乏T细胞、NK细胞及浆细胞淋巴瘤的相关数据分析，需要在日后的工作中增大样本量进行分析。

对于病理活检标本，在标本量足、具有代表性及细胞活力好的情况下，FCM能够快捷地提供淋巴瘤诊断、分型及质量相关的所有信息，为形态学诊断提供可能的方向。鉴于目前淋巴结增生性疾病还是以形态学为金标准的条件下，FCM对于淋巴结增生性疾病的诊断更为快速，是形态学有力的补充。