基于Cytoscape的miRNA调控网络的构建与研究*

杨 淼 杜 菁* 李冬果 杨秋英 刘文艳 姚红串

近年来，非编码核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，尤其是微小RNA(microRNA，miRNA)的研究越来越引人关注。miRNA是在真核生物中广泛存在的一类重要的非编码RNA，目前有超过2 500种miRNA已经在人类中注释[1]。成熟的miRNA是一类大小约21～23个核苷酸的非编码RNA，miRNA通过调节靶基因的表达水平影响到各种生物过程，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡以及脂肪代谢等。一个miRNA可以同时调控多个靶基因的表达，多个miRNA通过协同或组合关系调节靶基因[2]。因此miRNA与靶基因错综复杂的相互作用构成一种复杂的调控网络(regulatory network)，称为MiRNA-Target调控网络。在这个调控网络中，通过有向边，描述miRNA与靶基因之间的调控与被调控关系。

有研究表明，miRNA在调节癌症基因表达程序中具有重要作用，一些miRNA起肿瘤抑制剂的作用，而另一些miRNA异常过表达可促进肿瘤的发生、生长或进展[3]。因此，miRNA在调控网络中的作用有助于理解高等真核生物的基因组的复杂性[4]。

随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入，在MiRNA-Target调控网络中的节点数日趋庞大，要了解miRNA和靶基因之间复杂的“多对多”关系，最直观方式是使用基于网络的可视化方法，借助图论理论进行分析。

Cytoscape是一个基于Java技术的开放源代码的网络可视化软件平台，主要用于复杂生物网络分析研究设计，其可以绘制基因表达调控网络、蛋白互作网络等任何与网络结构、层级有关系的内容。Cytoscape软件为数据集成、分析和可视化提供了一套基本的功能，同时Cytoscape软件拥有大量的插件，这些插件提供了丰富的生物网络分析功能，目前Cytoscape软件的版本已经更新到3.6.1版。

1 材料与方法

1.1 miRNA数据获取

乳腺癌(breast cancer，BC)是迄今为止妇女中最常见的癌症。近年来，人们对在BC中表达异常的miRNA表达机制的研究已经取得了相当大的进展，并且发现了一些miRNA或miRNA家族作为BC标记的关键调控器[5-6]。尽管可以通过实验查找miRNA靶标基因，但是实验既耗时又昂贵，因此开发了大量的预测工具来预测miRNA的靶基因。

本研究选用BC与hsa-miR-125b-2-3p、hsamiR-125b-5p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-195-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-497-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-99a-3p和hsa-miR-99a-5p 10个最有差异性表达的下调miRNAs作为诊断BC的miRNA标志物，构建miRNA预测靶基因的调控网络[7]。采用生物网络分析软件Cytoscape3.6.1可视化乳腺癌的miRNA与预测靶基因之间的调控关系，并对靶基因进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路分析。

1.2 预测靶基因数据获取

miRWalk是迄今为止唯一自由开放，有关miRNA靶标相互作用的最大的数据库在线资源，目前miRWalk2.0提供了智人、小鼠和大鼠的miRNA靶基因信息。miRWalk数据内容分为预测模块和验证模块。预测模块提供了预测miRNA靶基因的功能，并与12个miRNA靶基因预测程序的预测结果进行比对。本研究使用miRWalk数据库获取miRNA的预测靶基因，采用TargetScan、Pictar2、miRanda以及RNA22预测工具[8]和miRWalk完成预测。为了降低假阳性率，同时被这5种方法预测标记的靶基因被选为调控网络中miRNA的预测靶基因。

1.3 miRNA-Target调控网络构建

Cytoscape软件支持多种格式输入，选择Cytoscape软件菜单“File|import|network|File”输入调控网络数据，并设置源点Source列和目标Target列及其属性列。生成初步的调控网络。

1.4 样式设置和网络布局

Cytoscape软件可用于设置节点(Node)、边(Edge)和网络(Network)的样式。选择Cytoscape软件“Control Panel”控制面板中的“Style”选项卡可对节点、边和网络进行样式设置。

网络布局主要设置节点和边在视图中的几何位置，根据网络的拓扑结构计算出各节点的几何位置，直观显示网络的拓扑结构。Cytoscape软件提供了多种布局算法，本研究选择力导向算法布局miRNA调控网络。力导向布局算法模拟力学物理，将节点建模为物理对象，将边作为将这些对象连接在一起的弹簧来布局整个网络。该算法可以快速的布局复杂网络中的节点，绘制一个清晰的网络布局图。选择Cytoscape软件菜单命令“Layout|Prefuse Force Directed Layout”，运行力导向布局，其中弹性系数为“1E-5”，弹性长度为“6”。

1.5 基因富集分析和KEGG通路分析

Cytoscape软件提供的插件生物网络基因本体论工具(biological networks gene ontology tool，BiNGO)，将识别的靶基因映射到GO的注释库中，对预测靶基因集合进行GO富集分析，实现靶基因的生物学功能识别。BiNGO可以构建基于基因集合的生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cell component，CC)的网络结构图，并找出富集的生物学注释。本研究对预测靶基因进行生物过程富集分析。在Cytoscape软件中，打开miRNA调控网络，选中需要映射的基因节点；选择Cytoscape菜单“Apps|BiNGO”，打开BiNGO对话框进行设置；选择统计学检验“Hypergenometric test”，以P＜0.05为显著性阈值，分别选择GO的BP作为映射文件，选择物种“Homo Sapiens”后，点击“Start BiNGO”按钮，运行BiNGO。

KEGG通路分析可用于发现共享相同通路的共表达基因簇，通过miRWalk数据库完成KEGG通路分析，显著性阈值P＜0.05。

2 结果

Cytoscape软件采用力导向布局绘制的MiRNATarget调控网络中大圆角矩形为miRNA，小圆形为预测的靶基因。调控网络中一共预测了791个靶基因，1062对调控关系。从miRNA调控网络可直观地看出，一个miRNA可调控多个靶基因，多个靶基因又同时被多个miRNA所调控(如图1所示)。

使用Cytoscape软件的插件BiNGO做GO富集分析，通过链接GO数据库得到靶基因的注释信息。结果显示，10个miRNA标志物中hsa-miR-195-3p、hsa-miR-139-5P、hsa-miR-195-5p和hsa-miR-497-5p在BiNGO富集分析中，有显著性差异。靶基因显著性富集的前5个生物学过程为生物调节，细胞过程调节，大分子代谢过程的调节和翻译后蛋白质的修饰。同时构建GO富集的生物学过程有向无环图，本研究仅列出hsa-miR-497-5p的靶基因的生物学过程有向无环图，其中有颜色的代表有显著性富集，颜色越深代表富集程度越高(如图2所示)。

图2 hsa-miR-497-5p预测靶基因富集分析生物学过程层次网络图

对靶基因的KEGG通路进行分析，结果得到303个基因富集在85条通路上。其中，有7条通路与乳腺癌有关，分别是p53信号通路，Hedgehog信号通路，Wnt信号通路，Notch信号通路，Jak STAT信号通路，Toll样受体信号通路和ErbB信号通路[9-12]。

3 结论

本研究通过5种预测方法预测出791个靶基因，利用预测的调控数据，建立了乳腺癌的肿瘤标志物MiRNA-Target调控网络，该网络中包含801个节点，791个预测靶基因，1062对调控关系，并用可视化工具Cytoscape软件构建并布局MiRNA-Target调控网络，对miRNA与靶基因之间的调控关系有了初步的了解。分析结果显示，10个miRNA标志物中，预测的靶基因在生物学过程中主要富集在调节功能上。KEGG通路分析中，预测的靶基因主要富集在7种信号通路中，这些通路与乳腺癌存在一定关系。

从生物信息角度，预测miRNA靶基因的算法，BiNGO富集分析，KEGG通路分析有助于找出要研究的基因和通路，为乳腺癌靶基因的实验验证及生物学功能的研究提供了理论指导，有助于乳腺癌的靶向治疗。