荷丹片对慢性非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的影响

徐丽瑛, 黎砚书, 郑国安, 吴金花, 丁 琦, 肖小华

(江西省医疗器械检测中心, 南昌 330029)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中医归属于“胁痛”、“痞满”、“肝胀”、“肝痞”、“肝癖”、“肝着”、“积聚”、“痰证”、“痰浊”、“湿阻”“瘀证”、“肥气”、“积证”等范畴[1]。其病机为脾肾亏虚，脾虚运化无力，肾虚气化不利，而致水湿停聚，进而生痰，痰湿内蕴，继而生热化瘀，而致痰、热、瘀、浊、湿纠结，继而伤肝[1]。荷丹片功能为化痰降浊，活血化瘀，由荷叶、丹参、山楂、番泻叶、补骨脂五味中药加工而成，临床用于高脂血症属挟痰浊瘀证侯者。由于临床应用显示其对脂肪肝患者有降脂作用，因此现将其进行二次开发成一种治疗脂肪肝的纯中药复方制剂。我们选用高糖高脂灌胃给予大鼠制作NAFLD模型，来探讨其治疗脂肪肝的药理作用，现将实验结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量140～170 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]。饲养于江西省药物研究所安全评价中心[SYXK(赣)2013-0004]。动物饲料由北京科澳协力饲料有限公司[SCXK(京)2014-0010]提供，自由饮食。

1.2 药品、试剂与仪器

荷丹片，由南昌济顺制药有限公司提供，每片重0.73 g，含生药14.125 g，批号： 20160601。血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司，每粒装0.3g，批号： 20160501。非诺贝特片，上海黄海制药有限责任公司，规格，0.1g/片，批号： 160301。血脂康胶囊，北京北大维信生物科技有限公司，规格，0.3g/粒，批号： 20160501。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒，购自中生北控生物科技股份有限公司; 还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测试盒，购自南京建成生物工程研究所; 胆固醇(C27H40O)，购自上海精析化工科技有限公司; 胆酸钠，购自北京市海淀区微生物培养基制品厂; 1,2-丙二醇，购自上海试剂一厂。

电子天平(MP15KC)，购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司; 半自动生化分析仪(BT-224)，购自意大利Biotecnica公司; 石蜡包埋机(TKD-BMC)，购自孝感泰康达医疗设备有限公司; 脱水机(TP1020)、轮转式切片机(RM2126)和摊片机(HI1210)，均购自上海徕卡仪器有限公司; 显微镜(Motic BA300)，购自麦克奥迪实业集团有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 慢性NAFLD模型的建立及分组[2-4]将大鼠按体质量随机分成7组, 每组10只, 分别为空白组、模型组、荷丹片低、中、高剂量组、血脂康胶囊组和非诺贝特片组, 再另取同批大鼠5只与模型组大鼠同样处理。除空白组外, 其余动物均灌胃给予高脂乳剂(玉米油400 g、胆固醇100 g、胆酸钠33 g、丙二醇300 mL)和高糖溶液(奶粉40 g、蔗糖75 g、蒸馏水100 mL), 灌胃容积均为5 mL/kg,每日1次，连续8周。于造模4周后，取造模大鼠2只解剖，剖取肝脏作病理切片，验证大鼠NAFLD模型是否成功；以大鼠肝脏呈灰黄色，镜检见中央静脉周围的肝细胞肿胀，胞质内出现脂肪空泡，判定为NAFLD造模成功。

1.3.2 给药 模型成功后，各组大鼠均于每日上午仍继续灌胃给予高糖高脂乳剂，下午灌胃给药，灌胃给药容积均为10 mL/kg，空白组和模型组给予等容积蒸馏水，1次/日，连续给药4周。

1.3.3 观测指标

1.3.3.1 大体观察 试验结束后处死全部动物，肉眼观察肝脏颜色、质地、大小等情况。

1.3.3.2 生化指标 末次给药后禁食12 h，经大鼠腹主动脉取血, 室温静置10 min后, 3 500 r/min离心15 min, 分离血清，按试剂盒说明书操作分别测大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL-C、HDL-C指标。脱颈椎处死大鼠, 剖腹取肝脏称其湿重, 并取肝脏同部位组织精密称定0.3 g, 剪碎后加入9倍质量分数0.9%氯化钠溶液，冰浴中手动制匀浆, 2 000 r/min离心10 min, 取上清液测GSH和MDA含量, 并取肝脏同部位组织精密称定0.2 g, 剪碎后加入9倍丙酮乙醇(1∶1)溶液中匀浆, 3 500 r/min离心15 min，取上清液测TG、TCH。

1.3.3.3 组织病理学 另取肝脏左叶，用体积分数10%甲醛固定，HE染色，于光学显微镜下观察各组织形态学变化, 拍摄照片。肝损伤病理组织学分级标准如下, 0级： 正常肝组织，无肝细胞变性、坏死, 无炎症细胞侵润; I级： 肝小叶内肝细胞轻度脂肪变性，偶见肝细胞点状坏死; Ⅱ级： 肝小叶内肝细胞中度脂肪变性，可见肝细胞点状坏死，炎症细胞侵润; Ⅲ级： 肝小叶内肝细胞重度弥漫性脂肪变性，点状坏死多见或可见大片肝细胞坏死。

1.4 统计学方法

采用DAS 3.0统计软件对各项血液学指标、生化指标、脏器系数进行t检验，对组织病理学指标进行Ridit检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模大鼠肝组织观察

造模4周后，解剖大鼠，见大鼠肝脏略偏大、表面呈灰黄色。镜检见中央静脉周围的肝细胞肿胀，胞质内出现脂肪空泡，表明造模成功(图1A)。

2.2 对NAFLD大鼠肝组织和血清生化指标的影响

造模8周后检测生化指标，模型组大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL含量明显高于空白对照组，HDL明显降低; 荷丹片各剂量组相对模型组上述指标有所改善 (P＜0.05或P＜0.01); 血脂康能显著降低模型大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL; 荷丹片各剂量能明显改善大鼠ALT、TCH、HDL、LDL指标水平, 与非诺贝特组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)(表 1)。

与空白对照组比较, 模型组大鼠肝组织MDA、TCH、TG含量升高、GSH含量降低(P＜0.01); 与模型组比较，荷丹片能显著降低模型大鼠肝组织MDA、TCH和TG。差异有统计学意义(P＜0.05);与非诺贝特组比较，荷丹片能明显改善大鼠GSH指标水平 (P＜0.05)，详见表2。

表 1 荷丹片对NAFLD大鼠血液生化指标的影响

表 2 荷丹片对NAFLD大鼠肝组织生化指标的影响

2.3 对肝系数的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肝系数增大(P＜0.01); 与模型组比较, 荷丹片对NAFLD大鼠肝系数无影响, 非诺贝特组大鼠肝系数增大明显 (P＜0.01),详见表3。

表 3 荷丹片对NAFLD大鼠肝系数的影响

2.4 对NAFLD大鼠肝组织病理学的影响

病理组织学检查, 空白组肝组织结构正常, 肝小叶结构清楚，细胞索排列整齐，肝血窦正常, 核圆，位于细胞中央，胞质均匀(图1B); 模型组中央静脉周围的肝细胞肿胀，胞质内出现脂肪空泡，肝小叶界限模糊, 小叶内出现多个点状或大片状坏死，汇管区见大量炎症细胞侵润(图1C)。荷丹片7.06 g/kg和14.12 g/kg组肝细胞肿胀不明显, 脂肪变性及炎症细胞侵润均较模型对照组显著减轻, 无大片状坏死(图1G、H)。荷丹片3.53 g/kg组时肝细胞肿胀较模型组减轻, 脂肪变性、炎症细胞侵润及坏死程度改变不明显(图1F)。血脂康0.1 g/kg组肝细胞肿胀，脂肪变性、炎症细胞侵润及坏死程度均显著降低(图1E)。非诺贝特0.05 g/kg组大鼠肝组织中央静脉周围的肝细胞肿胀，胞质内出现大量脂肪空泡，肝小叶界限模糊, 小叶内出现多个点状及大片状坏死，汇管区有炎症细胞侵润(图1D)。肝损伤病理组织学分级结果见表4。

3 讨论

NAFLD是一种无过量饮酒史, 但病理学改变类似酒精性脂肪性肝病，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征[2]，包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化[5,6]。同时现代医学认为脂肪肝是肝脏脂蛋白代谢紊乱，甘油三酯的合成速度大于将其泌入血液的速度, TG大量堆积于肝脏而致的一种病理改变[7]。NAFLD目前尚无特效治疗药物，现代医学主要是通过改善胰岛素抵抗，维持机体内环境脂质代谢、能量代谢和抗氧化物的平衡，促使机体保持在适应性反应阶段，延缓、阻止脂肪性肝病的病情进展。针对个体病情，可适当采取控制体质量的方式辅助治疗，终末期肝病需采取肝移植手术治疗。

图1 荷丹片对NAFLD模型大鼠肝组织病理学影响(HE×100)

表 4 荷丹片对大鼠NAFLD组织病理学的影响

我们采用含高糖高脂组成的乳液给动物灌胃复制的模型具有人类非酒精性脂肪性肝病的重要特征。模型组血脂、肝脂均比空白组显著增加, 镜检显示肝细胞肿胀, 出现脂肪空泡, 肝小叶内出现大片状坏死, 汇管区见大量炎症细胞浸润, 表明模型成功。

非诺贝特0.05 g/kg剂量能显著降低脂肪肝模型大鼠血清TG和肝组织TG，显著增加肝组织GSH;非诺贝特0.05 g/kg增加血清TCH、LDL，降低血清HDL。据文献报道，非诺贝特对肝脏有损伤作用，血清ALT、AST均升高[8]; 与试验结果一致。非诺贝特0.05 g/kg剂量显著增加大鼠肝系数，由于该组大鼠体质量显著降低，且非诺贝特对肝脏造成损伤，肝脏重量增加等原因所致。由于非诺贝特本身对肝脏具有损伤作用，会加重大鼠脂肪肝模型动物肝脏的损伤，解剖可见其肝脏明显肿大，且呈灰黄色，可能引起其脂质代谢紊乱，导致其血液中TCH和LDL增加、HDL下降。

本试验结果表明，荷丹片对NAFLD模型大鼠血清生化指标的改变具有明显改善作用，可降低血脂和肝脂，改善肝病理组织学改变，与阳性对照药非诺贝特比较，差异有统计学意义，但其剂量组间无明显差异，无剂量相关性，其作用机制可能为通过抗氧化作用，抗肝细胞坏死和抑制脂质吸收，减少TG合成等因素有关。