miR—let—7b通过调控相关细胞周期蛋白影响皮肤黑色素瘤的增殖和凋亡

秦琴 宁花兰 陈小燕

[摘要]目的：探讨miR-let-7b通过调控相关细胞周期蛋白影响皮肤黑色素瘤的增殖和凋亡。方法：qPCR法检测miR-let-7b在黑色素瘤组织和细胞株中的表达情况；双荧光素酶报告基因检测miR-let-7b与CCND1之间的相互作用；MTT增殖实验检测抑制miR-let-7b后黑色素瘤细胞的增殖能力的变化情况；流式细胞术检测抑制miR-let-7b后黑色素瘤细胞的凋亡行为的变化情况。结果：与癌旁正常皮肤组织相比，黑色素瘤组织中miR-let-7b的表达水平相对上调，与其他黑色素瘤细胞株相比，A375细胞中miR-let-7b表达最高；双荧光素酶实验证实miR-let-7b能与CCND1的3UTR特异性结合，可以调控CCND1的表达与活性；抑制miR-let-7b的表达后可以抑制黑色素瘤细胞的增殖能力；同时可以促进黑色素瘤细胞的凋亡行为。结论：miR-let-7b可以调控CCND1的表达从而影响黑色素瘤细胞的增殖和凋亡。

[关键词]miR-let-7b；黑色素瘤；CCND1；凋亡；增殖

[中图分类号]R739.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）07-0079-04

Abstract： Objective To investigate the effect of miR-let-7b on the proliferation and apoptosis of melanoma by regulating related cell cycle proteins. Methods Expression of miR-let-7b in melanoma tissues and cell lines was detected by qPCR. Double luciferase reporter gene was used to detect the interaction between miR-let-7b and CCND1. MTT proliferation assay was used to detect the proliferation of melanoma cells after inhibition of miR-let-7b. Flow cytometry was used to detect the apoptotic behavior of melanoma cells after inhibition of miR-let-7b. Results Compared with adjacent normal skin tissue， the expression level of miR-let-7b in melanoma tissue was relatively up-regulated. Compared with other melanoma cell lines， the expression of miR-let-7b was the highest in A375 cells. Double luciferase assay confirmed that miR-let-7b could specifically bind to the 3' UTR of CCND1 and regulate the expression and activity of CCND1. miR-let-7b can inhibit the proliferation of melanoma cells， And can promote the apoptosis of melanoma cells. Conclusion miR-let-7b can regulate the expression of CCND1 and affect the proliferation and apoptosis of melanoma cells.

Key words： miR-let-7b； melanoma； CCND1； apoptosis； proliferation

皮肤黑色素瘤是一种以侵袭性转移生长和预后不良为特征的皮肤恶性肿瘤[1]。黑色素瘤的发病率一直居高不下，且晚期患者的死亡率较高[2-3]。转移性黑色素瘤患者的中位生存时间为6个月，5年生存率低于5%[4]。遗传因素和过多的紫外线照射是黑色素瘤的主要危险因素[5]。研究探讨黑色素瘤的分子生物学发病机制有助于提高其临床诊断率和治療情况。微小RNA是在哺乳动物体内发现的一类小型非编码RNA，长度约为22～26个核苷酸[6]。miRNA通过不完全的碱基配对来调节基因表达过程，抑制非翻译区（3'-UTR）的结合进而影响mRNA表达稳定性[7]。相关研究数据表明，从核苷酸3'到5'端的核苷酸种子序列称为miRNA末端靶标，miRNA末端靶标通常在3'端具有相应的种子结合位点，然而单个miRNA可以调节数百个基因的表达，分子靶标之间的识别系统变得尤为重要[8]。重要的是，miRNA靶位点通常在许多物种的基因组中进化保守，这表明miRNA和蛋白的相互作用在生物学功能和行为上具有重要意义。最近的研究表明多种miRNA的表达失调在人类恶性肿瘤的发展过程中起重要作用，而且根据特异性miRNA和肿瘤类型，miRNA可以作为肿瘤抑制因子或致癌基因，具有明显的组织特异性[8]。但是在黑色素瘤中的具体作用方式尚未阐述清楚。本研究，首先检测了miR-let-7b在黑色素瘤组织和细胞株中的表达水平，然后通过流式细胞术检测其对黑色素瘤细胞增殖和凋亡行为的影响，明确细胞周期蛋白CCND1和miR-let-7b之间相互关系，为miRNA在黑色素瘤中的作用机制提供一定的理论支持。

1 材料和方法

1.1 标本来源：收集2016年7月-2017年1月在笔者医院行手术切除且经病理检查确诊为皮肤黑色素瘤的组织60例，同时取癌旁正常皮肤组织60例。离体后放入4%多聚甲醛中固定。全部患者术后病理分期均经2名副高以上病理科医师共同阅片确定，所有患者术前无化疗或放疗，黑色素瘤组织为原发病灶并经病理科证实，均自愿签署知情同意书。将60例黑色素瘤组织和相应配对的癌旁正常皮肤组织进行随机分组，分为5组，分别是S1，S2，S3，S4，S5，检测随机分组后肿瘤组织和癌旁正常组织中miR-let-7b的表达情况。

1.2 细胞株与主要试剂：人黑色素瘤M21，A375，B16，B78H1和Malme-3M细胞株均购买于复旦大学细胞库（在37℃，5% CO2条件下，含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养）。胎牛血清，RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司。Transwell小室购自美国Millipore公司，Matrigel购自美国BD公司。MALAT1，miR-20a及对照慢病毒购自上海吉凯制药技术有限公司。Lipofectamine 2000转染试剂购于日本TAKARA公司。逆转录试剂盒（FSQ-101）购自日本TOYOBO公司，PCR试剂盒购自美国Sigma公司。荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司。荧光素酶报告载体由Promega公司合成。

1.3 qPCR实验：使用miRNA提取试剂盒进行mRNA抽提，实验过程按照试剂盒使用说明进行，抽提之后，使用核酸浓度检测仪检测RNA浓度和纯度，最后将其浓度稀释至50μg/ml，使用特异性反转录引物进行cDNA合成，反应条件按照cDNA合成试剂盒使用说明进行设置。反应条件：95℃预变性10min、95℃变性15s、60℃退火32s，循环50次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本Ct值，然后采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。实验分为NC组和MALAT1-siRNA组，分别转染对照慢病毒和MALAT1-siRNA慢病毒。实验重复3次。miR-let-7b引物序列：5'-CGTTGTGTAGTCGATGCTAGGTCCA-3'（正向）和5'-ATTTCGCGTAGTGTAGGGGCTATAT-3（反向）。CCND1引物序列：5'-ATTTCGGGCTTTTATTTGGATCGAT-3'（正向）和5'-TTCGGGAGGTGCTGGAATGC-3（反向）。

1.4 雙荧光素酶实验：从人类基因组DNA产生全长miR-20a-3UTR，并通过退火合成的信号寡核苷酸产生突变体miR-let-7b-3UTR。miR-let-7b-3UTR WT代表野生型质粒载体和质粒结合共转染到293U细胞内，miR-let-7b-3UTR MUT代表突变型质粒载体和质粒结合共转染到293U细胞内，同时使用pGL-3.0（荧光素酶）作为内参照，检测NC组和MALAT1-siRNA组293U细胞中miR-let-7b的荧光活性相对值。使用Lipofectamine 2 000TM（Invitrogen）检测转染效率在孢菌素酶活性的基础上正常化。根据制造商的说明书，使用双荧光素酶报告系统试剂盒（Promega）测量萤火虫和海肾荧光素酶活性，通过双荧光素酶检测miR-let-7b对CCND1的表达活性的调控能力，明确miR-let-7b对CCND1荧光活性的调控情况。

1.5 MTT细胞增殖实验：将黑色素瘤A375细胞消化离心重悬，分为转染细胞组和未转染细胞组，使用96孔板，设置3个复孔，每空加入2×103细胞，在37℃、5% CO2的孵箱内培养。培养7d，每天分别按每100μl 培养基加入10μl CCK-8 液体，放于细胞培养箱内孵育1h，用酶标仪在450nm下检测各孔吸光值。以时间为横轴，以每个时间点各组细胞的吸光值比率为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡实验：将不同组的黑色素瘤细胞培养24h，然后用PBS洗涤3次。将1μM浓度的Hoechst染料加入各组中，20min染色，再用PBS洗涤3次，并在激光扫描共焦显微镜下观察细胞核型。将不同组的黑色素瘤细胞以2×106的密度接种在6孔板中，生长24h，加入100μl细胞悬液5μl Annexin V-FITC和10μl PI，并将细胞在黑暗中孵育30min。将PI（5μl，浓度为10μg/ml）加入细胞，在黑暗中再次孵育10min。通过流式细胞仪评估细胞识别细胞周期变化。

1.7 统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据用均数±标准差表示，计量资料用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-let-7b在黑色素瘤组织和细胞株中的表达情况：qPCR实验结果表明，5组黑色素瘤细胞株样本中，与其相邻的正常皮肤组织相比，miR-let-7b在黑色素瘤组织中均明显上调[（0.87±0.18）、（0.48±0.11）、（1.58±0.25）、（0.52±0.12）、（0.55±0.15）vs（0.10±0.00）]，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。不同黑色素瘤细胞株（M21，A375，B16，B78H1和Malme-3M）中检测miR-let-7b的表达情况，A375细胞中表达水平相对最高[（1.32±0.28）vs（1.39±0.27）vs（0.88±0.14）vs（0.32±0.08）vs（0.35±0.10）]，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。后续实验选取A375作为功能学实验的细胞株。

2.2 miR-let-7b与细胞周期蛋白的相互调控关系：本实验通过生物信息学网站预测与miR-let-7b具有互补碱基配对的蛋白分子，发现细胞周期蛋白CCND1的3UTR的序列与miR-let-7b结合位点相似（见图3）。通过双荧光素酶实验验证miR-let-7b和CCND1之间的相互关系，探索miR-let-7b对CCND1的分子调控机制。结果显示，抑制miR-let-7b的表达后可以下调野生型CCND1的3UTR的转录活性，而对于突变型CCND1则无明显的调控作用（见图4）。表明miR-let-7b可以直接调控CCND1的表达活性，影响其表达水平。

2.3 miR-let-7d在对黑色素瘤细胞增殖能力的影响：通过克隆形成实验检测miR-let-7b对黑色素瘤细胞增殖能力的影响。克隆形成实验结果如图5～6所示，与NC组细胞相比，在miR-let-7b-inhibitor组A375细胞的增殖情况受到明显的抑制[（0.98±0.08）vs（0.31±0.11）]，差异具有统计学意义（P<0.05）。表明抑制miR-let-7b的表达后，黑色素瘤A375细胞的增殖能力受到相应的抑制。

2.4 miR-let-7d在對黑色素瘤细胞凋亡行为的影响：通过流式细胞术实验进一步检查miR-let-7b对A375细胞凋亡行为的影响，实验结果显示（见图7～8），与NC组相比，miR-let-7b-inhibitor组细胞凋亡数目明显升高[（39.6±7.2）% vs（1.0±0.4）%，P<0.05]，G1期细胞周期进程明显停滞[（83.2±6.8）% vs（61.2±5.1）%，P<0.05]。表明抑制miR-let-7b的表达后可以促进黑色素瘤A375细胞的凋亡行为，加速其凋亡。

3 讨论

人皮肤黑色素瘤是黑色素恶性肿瘤中较常见的类型，相比其他部位的黑色素瘤类型发病率较高，且皮肤黑色素瘤患者的预后较差，主要原因是早期转移可能性大，晚期肿瘤治疗效果不佳，对多种化疗药物及放疗的反应不佳[9]。目前关于黑色素瘤的主要治疗方式有手术和放疗，手术针对局部黑色素瘤的治疗效果较好，而皮肤多部位的黑色素瘤的治疗主要依靠放疗[10]。所以研究黑色素瘤的分子生物学机制是改善目前临床治疗效果的有效途径，并可在一定程度上减少放疗的副作用。

miR-let-7b是在哺乳动物细胞内广泛存在的一种调控因子，miR-let-7b的异常表达与多种类型的肿瘤细胞的癌基因的表达相关，其在不同类型的肿瘤中扮演促癌或抑癌的作用，具有明显的组织特异性[11]。之前几项研究探讨了miRNA在黑色素瘤中的调节作用，使用定量实时PCR检查了157种miRNA在原发性黑色素瘤和良性痣中的相对表达水平[12]。 Appari等学者研究指出miR-let-7家族在原发性黑色素瘤组织中表达显着上调，并指出miR-let-7可能与相关蛋白靶点联合影响黑色素瘤细胞的转移行为[13]。而且miR-let-7b参与肿瘤细胞的细胞周期进程，可以调控细胞周期蛋白的表达，包括CCND1，E2F1，Cyclin A2和Cyclin D1等等。本研究专注于细胞周期调控蛋白CCND1和miR-let-7b之间的关系，并验证其为miR-let-7b的直接分子靶标。通过后续的克隆形成实验和流式细胞术检测CCND1和miR-let-7b对黑色素瘤细胞增殖凋亡行为的影响，明确miR-let-7b对黑色素瘤细胞增殖行为有一定的促进作用。以前的研究报道，子宫内膜样腺癌组织中miR-let-7b的表达明显低于邻近的正常子宫内膜[14]。而最近发现miR-let-7b的表达可以干扰实质性肿瘤中的进展过程，比如肝癌，胃癌及胰腺癌等，但是关于miR-let-7b在皮肤黑色素瘤中研究报道甚少，没有系统的阐释其具体的作用方式。本研究指出抑制miR-let-7b的表达可以在一定程度上降低黑素瘤细胞的增殖能力，并可通过下调细胞周期CCND1蛋白阻碍细胞周期的进展，促进细胞凋亡。尽管我们认为G1细胞周期阻滞是miR-let-7b表达下调后的结果，但不能排除其他途径参与调节的可能性。目前已发现在多种人类恶性肿瘤（包括甲状旁腺腺瘤，乳腺癌，结肠癌，淋巴瘤，肺癌，黑素瘤和前列腺癌）中CCND1的表达异常，尽管与良性痣相比，转移性皮肤黑色素瘤样本中CCND1蛋白水平较高，但是涉及的相关癌基因的转录或翻译过程也可能有CCND1的参与，表明CCND1的表达在黑色素瘤的发展过程中起到一定的调控作用。之前有研究指出可以通过丝裂原活化蛋白激酶途径诱导CCND1表达，并且通常在黑色素瘤中存在过度活化这现象[15]。结合本研究的结果一致表明，在黑素瘤细胞中，miR-let-7b可以抑制CCND1蛋白的表达，干扰细胞周期的进展，扮演促癌因子的作用。

综上所述，以上结果有助于解释黑素瘤中miR-let-7b和CCND1蛋白的异常表达的现象，并进一步阐释了两者在原发性皮肤黑色素瘤中必要作用，后续实验进一步了解miR-let-7b的下调是否是黑色素瘤迁移和侵袭行为的诱导因素。miR-let-7b在黑色素瘤细胞中具有有效的抗增殖作用，所以它可能成为黑色素瘤临床治疗的新型分子靶标。

[参考文献]

[1]Rastrelli M，Tropea S，Rossi CR，et al.Melanoma： Epidemiology， risk factors， pathogenesis， diagnosis and classification[J].In Vivo，2014，28（6）：1005-1011.

[2]Spencer KR，Mehnert JM.Mucosal melanoma： epidemiology， biology and treatment[M].Springer International Publishing，2016：295-320.

[3]Ali Z，Yousaf N，Larkin J.Melanoma epidemiology， biology and prognosis[J].EJC Suppl，2013，11（2）：81.

[4]Duschek N，Skvara H，Kittler H，et al.Melanoma epidemiology of Austria reveals gender-related differences[J].Eur J Dermatol，2013，23（6）：872-878.

[5]Nikolaou V，Stratigos AJ.Emerging trends in the epidemiology of melanoma[J].Br J Dermatol，2014，170（1）：11-19.

[6]Pfeffer SR，Grossmann KF，Cassidy PB，et al.Detection of exosomal miRNAs in the plasma of melanoma patients[J].J Clin Med，2015，4（12）：2012-2027.

[7]Mirzaei H，Gholamin S，Shahidsales S，et al.MicroRNAs as potential diagnostic and prognostic biomarkers in melanoma[J].Eur J Cancer，2016，53：25-32.

[8]Prasad R，Katiyar SK.Down-regulation of miRNA-106b inhibits growth of melanoma cells by promoting G1-phase cell cycle arrest and reactivation of p21/WAF1/Cip1 protein[J].Oncotarget，2014，5（21）：10636.

[9]Pereira DM，Rodrigues PM，Borralho PM，et al.Delivering the promise of miRNA cancer therapeutics[J].Drug Discov Today，2013，18（5）：282-289.

[10]Appari M，Babu KR，Kaczorowski A，et al.Sulforaphane， quercetin and catechins complement each other in elimination of advanced pancreatic cancer by miR-let-7 induction and K-ras inhibition[J]. Int J Oncol，2014，45（4）：1391-1400.

[11]Dror S，Sander L，Schwartz H，et al.Melanoma miRNA trafficking controls tumour primary niche formation[J].Nat cell Biol，2016，18（9）：1006-1017.

[12]Alegre E，Sanmamed MF，Rodriguez C，et al.Study of circulating microRNA-125b levels in serum exosomes in advanced melanoma[J].Arch Pathol Lab Med，2014，138（6）：828-832.

[13]Palkina NV，Shvetsova II，Kirichenko AK，et al.Inhibition of matrix metalloproteinases 9 and 13 affects the degree of lymphocytic infiltration and the expression levels of microRNA miR-21 and miR-let-7b in melanoma cells in vivo[J].Arkh Patol，2015，77（1）：41-47.

[14]Mahdipour M，van Tol HT，Stout TA，et al.Validating reference microRNAs for normalizing qRT-PCR data in bovine oocytes and preimplantation embryos[J].BMC Dev Biol，2015，15（1）：25.

[15]Stahl P，Seeschaaf C，Lebok P，et al.Heterogeneity of amplification of HER2， EGFR， CCND1 and MYC in gastric cancer[J].BMC Gastroenterol，2015，15（1）：7.

[收稿日期]2018-01-22 [修回日期]2018-03-14

編辑/朱婉蓉