白羊草Epichlo⊇属内生真菌的分离鉴定及其重金属耐受性

贾 彤,王瑞宏,曹苗文

山西大学黄土高原研究所,太原 030006

内生真菌(endophyte)为“生活在活体植物地上部分的组织中,而不引起宿主植物明显病害症状的真菌”[1]。草本、灌木、针叶树和藻类等都可成为内生真菌的宿主,其中最常见的宿主是禾本科植物。在温带天然禾草中,约十分之一植物感染内生真菌[2],早熟禾亚科约有30%植物感染内生真菌[3-4]。Epichlo⊇属内生真菌与冷季型禾草共生,全世界至少有30个属的禾草感染这种内生真菌,也是目前研究最为广泛的内生真菌之一[5-6],已命名的与天然禾草共生的Epichlo⊇属内生真菌共有43种[7]。例如,王志伟等从华东、华北以及西北等地区的鹅观草属(Roegneria)植物中发现Epichlo⊇yangzii[8]和Epichlo⊇sinicum[9]两种不同的特异性内生真菌。李春杰等从醉马草(Achnatheruminebrians)中得到Epichlo⊇gansuensis[10]。羽茅(Achnatherumsibiricum)在自然种群中感染的两种优势菌株为Epichlo⊇gansuensis和Epichlo⊇sibirica[11]。朱敏杰等[12]从羊草(Leymuschinensis)中分离得到Epichlo⊇bromicola内生真菌。此前,本课题组已对天然禾草白羊草(Bothriochloaischaemum)中内生真菌的分布调查发现,白羊草中感染的16种内生真菌分别为赤霉属(Gibberella)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)[13],但对白羊草中Epichlo⊇属内生真菌的研究还未见报道。

关于内生真菌提高栽培禾草的抗生物与非生物胁迫的研究较多,但关于尾矿区内生真菌感染对天然禾草的重金属抗性研究还相对较少。微量金属离子可满足微生物正常生长,过量则会产生毒害作用。高重金属环境中,有些微生物对多种重金属具有抗性,这些微生物在重金属污染的生物修复过程中发挥重要作用。大多数抗重金属微生物的研究集中于根际和非根际土壤微生物,对植物内生真菌重金属抗性的研究报道较少。有研究发现,紫霉属(Purpureocillium)内生真菌可以在铜胁迫条件下促进秋茄红树林生长[14]。Zhang等[15]研究3种深色有隔内生真菌(H93、H125 和 H114)都对Pb和Cd具有耐受性。康宇等发现接种深色有隔内生真菌能改善重金属 Cd 胁迫下紫茎泽兰的生长状态[16],并且深色有隔内生真菌通过调节植物激素平衡以及光合作用强度使玉米中Cd含量降低,进而促进玉米生长[2,17-18]。相对于菌根真菌,内生真菌存在于植物的地上部分,同时内生真菌感染对宿主植物的生长具有促进作用[16],染菌植物可能借助于菌丝本身对重金属的积累,使宿主具有较高生物量且根系活动加强,进而在修复重金属污染土壤中发挥作用。内生真菌宿主范围较广且可分离培养,例如青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)以及镰刀菌(Fusarium)等都是植物体内常见的内生菌。Epichlo⊇属内生真菌也能够提高寄主禾草对Al[19]、Zn[20]和Cu[21]的耐受性。内生真菌还可以影响宿主禾草对Fe、Zn、Cu、Ca和P等矿质元素的吸收和运输[19,22]。李川等研究发现,感染内生真菌可以提高宿主植物羽茅和高羊茅(Festucaarundinacea)对重金属锌的耐受性[18,23]。醉马草感染的Epichlo⊇gansuensis内生真菌可提高宿主的抗旱性、耐盐性[24]、和对重金属胁迫的耐受性[25-26]。

白羊草为禾本科孔颖草属多年生牧草,属于喜温性中旱生植物[27],属于根茎疏丛型下繁禾草,具有短根茎、根系发达、分蘖能力强、能形成大量基生叶丛的特点[28]。叶片无毛或少毛,茎顶着生有4～多数总状花序,颖果,具有有性及无性繁殖能力,寿命长达10年以上。适口性强,是一种优良水土保持型的牧草资源。白羊草群落是我国暖温带森林草原区有代表性的植被类型,也是落叶阔叶林区森林破坏后出现的次生植被类型[29],白羊草广泛分布于黄土高原东南部和南部的低山丘陵、梁峁顶部的温暖带地段[30]。本实验通过形态学描述和分子鉴定的方法,对铜尾矿库白羊草内生真菌进行分离和鉴定,探究与白羊草共生的Epichlo⊇属内生真菌特点,并通过对内生真菌进行不同重金属胁迫处理,探究与白羊草共生的Epichlo⊇属内生真菌重金属耐受性潜力,这为丰富禾草内生真菌资源,以及内生真菌资源在重金属污染土壤修复中发挥作用提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本研究试验样地位于山西省垣曲县,该地年均气温13.5℃,年均降水量631 mm。北方铜业铜矿峪矿十八河尾矿坝,沟口筑坝,坝体呈梯形。始建于1969年,初期坝高23.0 m,坝顶高程509.0 m。现已筑 14级子坝,坝顶高程564.2—570.8 m,平均坝高43.0 m,坝顶长度1714.8 m[31]。尾矿库坝体为人工堆积,将库区近坝体矿砂推至坝前,通过碾压处理将其压实形成坝体,其成分主要为尾矿土、尾矿砂和人工覆盖的黄土。各个子坝植物群落以白羊草为优势种。2015年7月,自上而下共设置9个不同恢复年限的样地,在每个样地采集白羊草30株。将白羊草带回实验室进行内生真菌的分离与鉴定,研究结果发现,不同子坝白羊草内生真菌为赤霉属、镰刀菌属、青霉属(Penicillium)[13]以及Epichlo⊇属。通过用强氧化物对白羊草地上部分进行消解,再将消解产物用等离子体发射光谱仪(iCAP 6000, Thermo Fisher, UK)测定其重金属含量[32]。重金属进行检测,结果发现As含量为0.46 mg/L,Cd含量为3.07 mg/L,Cr含量为658.55 mg/L,Cu含量为153.29 mg/L,Pb含量为194.82 mg/L,Zn含量为62.35 mg/L。

1.2 内生真菌分离及孢子观察

首先进行植物表面灭菌,将白羊草叶鞘剪成约1 cm的小段,放入70%的酒精中5 s,再用5%的次氯酸钠浸泡7 min,在浸泡过程中不断摇晃,倒掉次氯酸钠加入无菌水,用无菌水清洗至少3次,每次30 s。将表面灭菌后的茎段横放或插入配制好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)中,置于25℃培养[12]。待真菌从培养基上长出来后,对单一菌落进行纯化,纯化4代后,菌落形态保持世代不变后进行孢子形态观察。将无菌水滴在载玻片上,挑取菌丝置于载玻片上,盖上盖玻片用数码成像显微系统(Moticam Pro 205A,Motic,Germany)观察[9]。

1.3 内生真菌的分子鉴定

内生真菌DNA提取[8]：提出来的DNA用多功能酶标仪(Infinite M200Pro NanoQuant,TECAN,Austria)测定其浓度和纯度,并用1%的琼脂糖凝胶电泳观察提取结果[13]。PCR反应：将提出来的DNA稀释至10 ng/μL,选用引物见表1[5]。act反应体系50 μL,含有：Template 10 μL,act-F、act-R 各1.0 μL(10μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30 μL。根据曹苗文等所设置的条件进行调整[13],下同,反应条件为：94℃,9 min;94℃,1 min;52℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40个循环;Tub反应体系50 μL,含有：Template 10 μL,Tub-F、Tub-R 各0.8 μL(10 μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30.4 μL。反应条件：94℃,9 min;94℃,1 min;54℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40个循环;tef反应体系50 μL,含有：Template 10 μL,tef-F、tef-R 各1.0 μL(10 μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30 μL。反应条件：94℃,9 min;94℃,1 min;60℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40个循环[7- 8]。经琼脂糖凝胶电泳确定PCR结果,选择最佳PCR产物送至华大基因有限公司测序。

表1 用于tubB、tefA 和actG PCR 扩增的引物

1.4 重金属胁迫处理

向YM液体培养基(每1 L蒸馏水中有麦芽糖3 g,酵母粉3 g,蛋白胨5 g和葡萄糖10 g)中加入不同浓度的重金属溶液,基于前期对铜尾矿坝土壤及白羊草叶片和根重金属的背景调查,分别利用ZnSO4,CuSO4,PbSO4,CdCl2母液设置重金属胁迫梯度为Zn2+(0、20、40、60、80、120 mg/L),Cu2+(0、20、40、80、120、160 mg/L),Pb2+(0、60、120、180、240、300 mg/L),Cd2+(0、2、4、6、8 mg/L),每个浓度设置3个重复。无菌条件下,从活化后的内生真菌液体培养基上吸取350 μL菌悬液于YM培养基中,将其放置到恒温培养振荡器(ZWY- 200D)中培养(200 rpm,25℃),根据白羊草内生真菌生长曲线的结果,本实验将内生真菌生长的测定时间确定为15天。培养结束后,用灭菌滤纸过滤收集内生真菌,放入烘箱65℃烘干称重,计算菌丝生长量。菌丝体干重的计算：过滤菌液前将滤纸标号并称重,在烘箱中至恒重后用电子天平称滤纸干重,烘干后滤纸的干重与过滤前滤纸差值即为菌丝体干重。

1.5 分子系统学分析

对于序列数据,首先把测序结果前端和后端的杂峰序列去除,然后在National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库进行BLAST比对。先使用MEGA6校准,然后去除比对序列两端多余的部分,使序列等长,然后运用最大似然法(Maximum-Likelihood法)进行系统发育分析,制作系统进化树,同时计算遗传距离。

1.6 统计分析

不同重金属胁迫下内生真菌生长量的均值比较采用SPSS 19.0进行单因素方差(One-way ANOVA)分析,并进行Duncan显著性检验,结果采用SigmaPlot 12.5进行作图。

2 结果与分析

2.1 白羊草内生真菌形态学特征

菌落在25℃、PDA培养基上生长4周的直径为23.2—39.1 mm。菌落白色、棉质、紧实、在培养基表面突出、无回旋或呈轻微回旋状;气生菌丝透明、丰富、光滑;菌落背面浅黄色。培养条件下孢子丰富,产孢细胞在气生菌丝上侧向生长,分生孢子透明,椭圆形或肾形,大小为1.2—8.0 μm(图1,表2)。

图1 白羊草中Epichlo⊇ sibiria的菌落(a)和分生孢子形态(b,c)Fig.1 Colony(a) and conidia(b,c) of Epichlo⊇ sp. isolated from B. ischaemum照片拍摄于菌株(Epichlo⊇ sp.)在PDA培养基上黑暗培养3周后。左：标尺= 1 mm;中：标尺=10 为μm

编号Number孢子大小/μmSpore size生长速率Growth rate/(mm/周)编号Number孢子大小/μmSpore size生长速率Growth rate/(mm/周)Epichloë sp.01(1.208—3.642) × (1.703—3.642)8.248±1.011Epichloë sp.05(2.036—3.115) × (2.036—5.260)9.788±2.432Epichloë sp.02(3.025—3.025) × (3.025—5.122)6.239±0.164Epichloë sp.06(2.067—4.931) × (2.067—7.718)8.248±1.835Epichloë sp.03(1.876—2.626) × (1.876—5.281)7.180±0.204Epichloë sp.07(1.360—3.054) × (1.360—6.773)6.332±0.166Epichloë sp.04(1.997—4.188) × (1.997—8.048)5.810±0.120

2.2 白羊草内生真菌部分Epichlo⊇ sp.菌株tubB、tefA 和actG 扩增结果

用Moon 等[23,25]设计的引物(表1),分别对白羊草内生真菌actG、tefA和tubB进行扩增,结果显示：3 对引物在所有菌株的actG、tefA和tubB扩增中,都得到了清晰的片段,大小分别为1600 bp, 800 bp和940 bp左右(图2)。

图2 部分白羊草内生真菌actG、tefA 和tubB扩增结果 Fig.2 Some PCR products of actG, tefA and tubB from endophytes associated with B. ischaemum

2.3 白羊草内生真菌系统发育分析

从不同白羊草叶鞘中分离得到的内生真菌在菌落形态和生长速度上都具有典型的Epichlo⊇属内生真菌的特征 (图1)。将白羊草叶鞘分离出的内生真菌对actG,tubB和tefA 片段进行PCR扩增并测序,将测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对,结果发现,这些内生真菌与Epichlo⊇属菌相似性达到97%以上。将这些菌株序列与白羊草内生真菌进行系统发育分析。从actG系统发育树可以看出,白羊草内生真菌与羽茅和醉马草中的E.gansuensis和羽茅中的E.sibirica相似可能性较大(图3);从tefA系统发育树结果可知,白羊草内生真菌与E.sinicum系统发育距离最近,其次为E.chisosum,而与E.gansuensis和E.bromicola形成了一个亚枝(图4)。tubB的系统发育树结果显示,白羊草内生真菌首先与鹅观草属植物中E.sinicum聚合在一起,然后与来自日本两种冰草属(Agropyronciliare和Agropyrontsukushiense)菌株形成一亚枝(图5)。

图3 根据actG序列,使用最大似然法(ML)构建系统发育树Fig.3 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of actG sequences进化枝上显示的数字(≥50%)表示1000 次自展检验后的置信度

图4 根据tefA序列,使用最大似然法(ML)构建系统发育树Fig.4 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of tefA sequences进化枝上显示的数字(≥50%)表示1000 次自展检验后的置信度

图5 根据tubB序列,使用最大似然法(ML)构建系统发育树Fig.5 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of tubB sequences进化枝上显示的数字(≥50%)表示1000 次自展检验后的置信度

2.4 白羊草内生真菌对重金属的耐受性

由图可知,随着Zn2+浓度的增加,内生真菌干重呈现先下降后上升的趋势,在Zn2+浓度为20 mg/L是内生真菌干重达到最低值为0.12 g,在浓度为80 mg/L,干重达到最大值为0.28 g(图6)。随着Cu2+浓度升高,内生真菌干重呈现先升高后下降的趋势,Cu2+浓度为40 mg/L时,内生真菌干重达到最大,且显著高于对照组。浓度从40 mg/L到120 mg/L时菌丝干重缓慢降低(图6)。Epichlo⊇属内生真菌对Pb2+胁迫的响应表现为,当Pb2+为240 mg/L,菌丝干重达到最大值,并且显著高于其他各浓度下菌丝重量(图6)。对于Cd2+胁迫而言,各个梯度下内生真菌干重均无显著差异(图6)。

图6 不同重金属胁迫下白羊草内生真菌的菌丝干重Fig.6 The dry weight of Bothriochloa ischaemum endophytes under different heavy metal stresses

3 讨论

本研究首次从白羊草中检测并分离得到Epichlo⊇属内生真菌。tubB和tefA序列系统发育分析表明,白羊草内生真菌与来自羽茅的E.sibiria非常相似,支持率分别达99%和98%,与冰草属禾草上的Epichlo⊇ 菌株以及雀麦属(Bromus)禾草上分离到的E.bromicola相似可能性较大,进化树上自展率为94%。在通过actG基因序列得到的ML系统发育树中,白羊草内生真菌与来自羽茅上的E.sibiria和E.gansuensis菌株相似性较高,支持率分别达99%和100%,但白羊草内生真菌的形态特征与羽茅中E.gansuensis不尽一致,具体表现为：从羽茅中分离纯化的内生真菌在PDA培养基上生长速度快,并且菌落表面更加光滑和致密[11-12],而本研究中,白羊草内生真菌生长速度缓慢,并且与羽茅中E.sibiria内生真菌的特征描述相似。通过形态学和分子系统发育学分析,将白羊草内生真菌鉴定为Epichlo⊇sibiria。前期研究结果发现,不同恢复年限分离得到的白羊草内生真菌分别为赤霉属、镰刀菌属、青霉属[13]以及Epichlo⊇属。把白羊草内生真菌与已知吸附重金属的内生真菌做系统进化树分析,发现Epichlo⊇属和白腐菌有较近的亲缘关系,白腐菌对镉有良好的吸附作用,白羊草能够生活在镉污染土壤的植物体内,可能由于Epichlo⊇sibiria对镉也有吸附作用。分子鉴定结果揭示与白羊草共生的内生真菌特点,为今后研究白羊草-内生真菌共生体的生理生态特征提供科学基础。

Vivas 等在锌污染的土壤中筛选到抗100 mg/L Zn2+的短芽孢杆菌属(Brevibacillus),羽茅内生真菌在Zn2+胁迫下的半致死浓度为80 mg/L[35],与已报道的细菌和内生真菌的重金属抗性相比,本研究中白羊草内生真菌在120 mg/L的Zn2+胁迫处理下能继续生长,说明白E.sibiria内生真菌自身对Zn2+具有较高抗性。Wu 等在铅锌尾矿土中筛选到对100 mg/L Cu2+和300 mg/L Pb2+都有较强抗性的固氮菌属和芽孢杆菌,本试验中铜尾矿坝白羊草E.sibiria内生真菌表现出对240 mg/L Pb2+和160 mg/L Cu2+都有一定抗性,这可能是由于植物内生真菌专性寄生于宿主体内,长期以来形成密切的共生关系,与细菌相比,真菌呈丝状生长且生长快,生物量大,因而抗重金属能力优于内生细菌[36]。已有研究发现,高羊茅内生真菌和羽茅内生真菌对Cd2+胁迫的耐受浓度分别为1 mg/L和5 mg/L[35],而白羊草内生真菌对Cd2+胁迫的耐受浓度为8 mg/L。本研究中分离纯化得到的铜尾矿坝白羊草E.sibiria内生真菌,对重金属Zn2+、Cu2+、Pb2+和Cd2+具有较高水平的抗性。这可能是内生真菌通过表面的吸附作用,或是菌丝分泌出多糖物质的结合作用使重金属的毒性降低[37]。因此,白羊草内生真菌在多种重金属污染的土壤修复过程中可能会有更大的适用性,特别是在铜矿区生态修复过程中,白羊草内生真菌可能对提高宿主抗性方面具有一定潜力。

4 结论

利用PDA培养基分离的方法,从白羊草中分离出的菌株菌落正面呈白色,背面浅黄色。菌落质地致密,形状为中间突出。生长速度较慢,位于5.810—9.788 mm/周之间,孢子大小为1.208—8.048 μm之间,孢子形态椭圆、球型。通过进行actG、tefA和tubB扩增、测序和系统发育分析 将白羊草内生真菌鉴定为Epichlo⊇sibiria。铜尾矿坝白羊草E.sibiria内生真菌对重金属Zn2+(120 mg/L)、Cu2+(160 mg/L)、Pb2+(240 mg/L)和Cd2+(8 mg/L)具有耐受性。