骨化三醇对桥本甲状腺炎大鼠血清炎性细胞因子表达的影响及其意义

杨雪威，王思源，赵佳，徐锦江

(1.锦州医科大学附属第一医院 健康管理中心，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院 心内科，辽宁 锦州 121000；3.锦州医科大学附属第一医院 肝胆外科，辽宁 锦州 121000)

桥本甲状腺炎是一种自身免疫性疾病，桥本甲状腺炎甲状腺组织中有大量淋巴细胞浸润，因此又叫慢性淋巴细胞性甲状腺炎[1]。该病在30～50岁常见，在女性中多发，发病隐匿，容易造成误诊[2]。桥本甲状腺炎的治疗主要为糖皮质激素、甲状腺激素、免疫疗法等缓解桥本甲状腺炎的症状，但上述治疗副作用和局限性较大[3]。研究发现自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等多种自身免疫性疾病的发生和维生素D缺乏有关[4- 5]，骨化三醇为维生素D的活性形式[6]。本研究建立实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠模型，并给予骨化三醇治疗，观察骨化三醇对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠血清炎性细胞因子水平的影响，探讨骨化三醇对桥本甲状腺炎的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性、清洁级、5～7周龄、120～140 g SD大鼠36只，购自北京生命科学研究所，许可证号：SYXK(京)2015- 0002。

1.1.2 主要试剂 抗甲状腺球蛋白抗体(anti- thyroglobulin antibodies,TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、肿瘤坏死因子- α(tumor necrosis factor- ɑ，TNF- ɑ)、白细胞介素- 1(interleukin- 1，IL- 1)、白细胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)ELISA试剂盒(美国Sigma公司)，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、甲状腺球蛋白(美国Sigma公司)，骨化三醇(青岛正大海尔制药有限公司)等。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠分组及模型制作 将36只大鼠随机分为对照组、模型组和骨化三醇组，每组12只。对照组大鼠正常饲养，不做任何处理。模型组及骨化三醇组大鼠制备甲状腺炎模型。实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠模型建立[7]：50 ml双蒸水中加入甲状腺球蛋白100 mg 彻底溶解，和完全弗氏佐剂等体积调匀，取0.5 ml 在大鼠颈部、腿部、腹腔、背部等多点皮下注射进行初次免疫，在同一时间及相同部位对对照组大鼠注射同等剂量的生理盐水；第2周开始对大鼠进行加强免疫：将10 ml甲状腺球蛋白和等量不完全弗氏佐剂混合后，对大鼠进行多点皮下注射，每周注射1次至第7周，并给予高碘水喂养，对照组大鼠正常饮水。7周后取大鼠眶静脉血，采用ELISA法测定血清TPOAb水平，血清TPOAb水平>60 IU·ml-1为造模成功，24只大鼠均建模成功。

1.2.2 各组大鼠处理 造模成功后，骨化三醇组大鼠给予骨化三醇花生油溶液(0.045 μg·kg-1)灌胃，每天1次，共10周；对照组和模型组大鼠每天给予等量花生油灌胃，共10周。10周后麻醉成功后打开腹腔取动脉血进行甲状腺抗体、甲状腺功能、血清炎性细胞因子水平检测，然后处死大鼠，取甲状腺组织进行甲状腺组织形态学观察。

1.2.3 大鼠甲状腺组织形态学观察 将大鼠甲状腺组织在福尔马林溶液中固定，并脱水透明、浸蜡、包埋，切成4 μm厚的切片，放入温水中使切片展平，将石蜡切片置于载玻片中间，放入烤箱中烘烤20 min，伊红染色5 min，光镜下观察各组大鼠甲状腺组织形态学变化。

1.2.4 血清甲状腺抗体、甲状腺功能、血清炎性细胞因子水平测定 将大鼠动脉血离心取血清，采用ELISA法测定血清TGAb、TPOAb、TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平；采用化学发光法检测血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)、促甲状腺激素(thyroid hormone，TSH)水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 3组大鼠甲状腺组织形态学变化

光镜下见：对照组大鼠甲状腺滤泡呈椭圆形或圆形，甲状腺上皮细胞排列均匀、整齐，未见浆细胞和淋巴细胞浸润；模型组大鼠甲状腺滤泡萎缩成扁平形或被大量破坏，大小不等、排列杂乱，内有浆细胞浸润，甲状腺上皮细胞排列紊乱，见明显淋巴细胞浸润；骨化三醇组甲状腺滤泡排列基本规则，偶有浆细胞浸润，甲状腺上皮细胞排列尚可，少量淋巴细胞浸润。

2.2 3组大鼠甲状腺抗体和甲状腺功能比较

3组大鼠TGAb、TPOAb、FT3、FT4、TSH比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中模型组和骨化三醇组TGAb、TPOAb、FT3、FT4均高于对照组(P<0.05)，TSH均低于对照组(P<0.05)；骨化三醇组TGAb、TPOAb低于模型组(P<0.05)，骨化三醇组FT3、FT4、TSH和模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表13组大鼠甲状腺抗体和甲状腺功能比较

组 别nTGAb/IU·ml-1TPOAb/IU·ml-1FT3/pg·ml-1FT4/pg·ml-1TSH/μIU·ml-1对照组118.12±2.018.64±2.695.21±0.3617.28±5.243.69±1.64模型组10258.19±32.14a144.25±12.46a32.14±6.39a112.31±9.26a0.19±0.04a骨化三醇组1094.23±19.46ab69.27±10.28ab31.61±5.68a110.67±10.34a0.20±0.03aF值367.895557.718107.205439.13045.086P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.3 3组大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平比较

3组大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中模型组和骨化三醇组血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平均高于对照组(P<0.05)，骨化三醇组血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平低于模型组(P<0.05)，见表2。

3 讨 论

实验性自身免疫性甲状腺炎的建模方法有多种，高碘诱导实验性自身免疫性甲状腺炎是利用高碘对抗体的刺激及对甲状腺上皮细胞的破坏建立动物模型；免疫介导结合高碘诱发建立实验性自身免疫性甲状腺炎动物模型是将免疫介导和高碘诱发相结合建立实验性自身免疫性甲状腺炎动物模型，本实验选用此法建立大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎模型。其机理在于甲状腺球蛋白诱导自身免疫，产生TGAb抗体，介导NK细胞毒性，破坏甲状腺靶细胞；滤泡内的甲状腺球蛋白引起机体免疫调节紊乱，引起B淋巴细胞产生TPOAb和TGAb等抗体，引起甲状腺自身免疫的发生[8- 9]。本法建立的实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠模型TPOAb和TGAb水平明显升高，且甲状腺组织中见滤泡受损，淋巴细胞弥漫性浸润，表明模型均建立成功。

表23组大鼠血清TNF- ɑ、IL-1、IL-6水平比较

组 别nTNF-ɑ/pg·ml-1IL-1/pg·ml-1IL-6/pg·ml-1对照组1144.36±7.23114.25±35.1653.23±13.24模型组1068.72±13.24a278.16±64.13a121.26±15.41a骨化三醇组1053.43±10.26ab187.19±51.47ab87.19±16.01abF值14.47826.94354.805P值<0.001<0.001<0.001

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

维生素D在钙磷代谢的动态平衡调节中发挥重要作用，与甲状腺功能有密切关系[10]。人体内有多种细胞表达维生素D受体，维生素D通过和其受体结合发挥多种生理功能，维生素D可充当免疫调节因子参与多种器官免疫性疾病的发生，桥本甲状腺炎的发生和血清维生素D水平降低有关[11- 12]。骨化三醇可通过旁分泌和内分泌的方式发挥作用，是维生素D的活性形式[13]，口服维生素D可降低桥本甲状腺炎患者的甲状腺自身抗体水平，改善桥本甲状腺炎的自身免疫反应。本研究对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠给予骨化三醇治疗，结果发现实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺滤泡和甲状腺上皮细胞排列紊乱，有浆细胞和淋巴细胞浸润，甲状腺TGAb、TPOAb水平明显升高；骨化三醇可有效改善实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺组织的形态学变化，降低甲状腺TGAb、TPOAb水平。本研究也表明骨化三醇对桥本甲状腺炎具有治疗作用，骨化三醇可能通过旁分泌和内分泌的方式降低实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺自身抗体滴度，从而发挥对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的治疗作用。

在桥本甲状腺炎的发病过程中，细胞免疫发挥关键作用，随着桥本甲状腺炎的进一步恶化，甲状腺细胞和淋巴细胞释放大量细胞因子，引起血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6等细胞因子水平升高，TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6等细胞因子和甲状腺自身抗体之间相互影响，引起甲状腺的病理改变[14- 15]。TNF- ɑ为促炎细胞因子的一种，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，参与免疫反应和炎症反应，在恶性肿瘤、慢性炎性疾病、败血症、免疫性疾病等多种病理状态下产生增多[16]。IL- 1又称为淋巴细胞刺激因子，主要由活化的单核- 巨噬细胞产生，具有免疫调节功能，可促进B细胞增殖、分泌抗体，协同刺激T细胞活化[17]。IL- 6是趋化因子家族成员，主要由成纤维细胞、血管内皮细胞、Th2细胞、单核巨噬细胞产生，具有促进血细胞发育，参与炎症反应，刺激T细胞增殖和活化，促进B细胞增殖、分泌抗体等生物学功能[18]。桥本甲状腺炎为自身免疫性疾病，其血清TNF- ɑ、IL- 1水平升高，可引起IL- 6水平升高、B细胞抗体数量增多，大量的浆细胞可破坏甲状腺滤泡上皮细胞，TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平的升高和甲状腺滤泡的破坏过程直接引起桥本甲状腺炎的发生[19- 22]。本研究结果发现：实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平升高，骨化三醇可明显降低实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平。骨化三醇对桥本甲状腺炎的治疗作用可能与骨化三醇可降低桥本甲状腺炎血清TNF- ɑ、IL- 1、IL- 6水平有关。