捕食性真菌Duddingtonia flagrans捕食马圆线虫幼虫动态观察

李军燕，罗宏亮，王 瑞，杨莲茹，赵治国，张 伟，李 斌，杨晓野*，罗晓平

(1.内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018; 2.内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所,呼和浩特 010031; 3.内蒙古出入境检验检疫局,内蒙古呼和浩特 010020; 4.新疆农业大学,新疆乌鲁木齐 830052; 5.金宇保灵生物药品有限公司,内蒙古呼和浩特 010020)

捕食线虫性真菌在自然界中广泛存在，它们大都生长在腐烂的树叶、木材、苔藓、腐殖质土壤及动物粪便中。近几十年，国内外研究学者研究最多的捕食性真菌为少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)和Duddingtoniaflagrans，并取得了丰硕的成果[1-3]。

这些捕食性真菌特有的捕食性器官——菌环、菌网等结构特征明显，是国内外科学家关注最多的一类杀线虫天敌。它通过产生捕食性器官捕获并杀死线虫，进而将线虫消化。其中D.flagrans菌可产生大量的厚壁孢子，在通过动物的胃肠道时不易被消化，能随粪便一起排出体外[4-6]。条件满足时，其孢子萌发为菌丝，进而产生捕食器官，捕获杀死粪便中发育的线虫幼虫，从而显著降低环境中感染性幼虫的数量而起到生物防治的作用。

在兽医领域中，利用捕食线虫性真菌作为一种新的防治寄生虫手段在国外已开展了广泛的研究，且在农作物线虫的生物防治上已有了商品化的捕食线虫真菌制剂[7]。内蒙古农业大学杨晓野教授带领的科研团队在研究少孢节丛孢菌和D.flagrans生物学特性和杀虫作用等方面，取得了许多重要的研究成果[8-9]。但从国内外来看，对捕食线虫性真菌详细的捕食过程和机制尚不完全清楚，这就要求我们首先应对捕食性真菌捕食器萌发、产生及捕食线虫过程的一系列动态变化进行详尽的了解。因此，本试验对捕食性真菌在捕食线虫的过程中产生的细微变化，如捕食器的形成过程、捕获虫体前后的变化等进行了详细的观察。以线虫第3期幼虫作为诱导物，在玻片培养基中刺激捕食性真菌产生捕食器，然后对其捕食线虫过程进行了适时动态的观察，这为今后深入研究捕食性真菌的捕食机制提供了基本的数据资料。

1 材料与方法

1.1 材料

普通琼脂粉，北京化学试剂公司进口分装；新鲜玉米粉，购自集贸市场；马圆线虫3期幼虫，来源于内蒙古农业大学动物园。

1.2 方法

1.2.1 0.4 g/L玉米粉琼脂(CMA)玻片培养基制备 称取40 g新鲜玉米粉，加入1 000 mL去离子水，微火煮沸1 h，补足水分至1 000 mL，用350目纱网过滤，然后取滤液10 mL，加去离子水990 mL，pH调至6.0～6.2，再加琼脂粉20 g，经121℃ 25 min高压灭菌。冷却至室温后，倒入装有载玻片的直径为90 mm培养皿中，液面以刚刚没过载玻片为宜。待培养基凝固后，用手术刀沿载玻片边缘将薄片培养基小心切下，放入新的无菌培养皿中。

1.2.2 供试线虫培养、收集和灭菌 将采自内蒙古农业大学动物园的新鲜马粪，轻轻碾碎，置于干净的搪瓷盘中，顶部稍高于搪瓷盘边缘，其上盖一块灭菌纱布，盖好搪瓷盘盖，置于28℃恒温箱中。定时搅拌疏松粪便，并喷洒适宜蒸馏水保持湿度。培养10 d～14 d后，用灭菌蒸馏水将盖上的L3冲洗到无菌烧杯中，自然沉淀后弃去上清，放置保存备用。

将上述制备好的马圆线虫三期幼虫(L3)悬浮液计数后，调整每毫升虫体数约为4 000 条/mL，每个EP管中加入1 mL，然后用无菌水4 000 r/min洗涤离心5 min，重复3次。最后一次离心后弃掉上清，在沉淀物中加入5 mL/L的甲醛，浸泡15 min，然后再用前述方法，进行3次无菌水同样洗涤。最后按青霉素200 U/mL、链霉素200 U/mL、卡那霉素100 μg/mL、制霉菌素12.5 μg/mL、两性霉素B 5.0 μg/mL加入抗生素复合液，4℃作用过夜。之后，4 000 r/min离心5 min，弃去上清。再用无菌去离子水离心洗涤数次，尽可能去除残余的抗生素。

1.2.3 捕食性真菌D.flagrans的捕食过程研究 在超净工作台中，取实验室已培养好的D.flagrans培养基，在菌丝生长均匀处用无菌手术刀切下直径约为5 mm左右的琼脂块，倒置放在玻片培养基的中间，接种3个培养基，设置1个对照组。最后再放入直径120 mm的无菌培养皿中(提前铺有无菌滤纸，外加少许无菌蒸馏水以保持湿度)，后置28℃恒温培养箱中培养。培养到第3天时，加入马圆线虫三期幼虫，对照组不加。于接种后每隔2 h观察1次，次日起每天观察1次，连续观察数天，拍照记录。

2 结果

2.1 D.flagrans菌环及菌网形成

经对捕食性真菌D.flagrans捕食线虫的动态过程观察后得知，接种有较强活力的线虫三期幼虫2 h后，捕食器1菌环开始萌芽，逐渐生长呈半环状，最后闭合为一个完整的环形(图1)，近似圆形或椭圆形。但开始时，菌环数量产生较少，以后随着时间的延长，逐渐增多。从1个菌环上左右可长出2个粗壮的小分枝(图2)。这些分枝向不同的方向弯曲生长，重新闭合于原来的菌环或菌丝，从而形成多个菌环(图3)。在接种4 h后，多个菌环继续分枝，再与原菌环或其他菌环相接，最后形成菌网(图4)，组成每个菌网的菌环数目各不相同。

2.2 D.flagrans捕食线虫动态过程观察结果

当菌环和菌网大量形成后，即加入虫体4 h后，有部分三期幼虫被捕获(图5)，被套捕的部位各不相同，大部分在头颈部和尾部，有一些则在身体的中部。在镜下可观察到线虫不停的挣扎扭动。在被捕获24 h后，线虫完全致死。接种5 d后，被捕获的虫体体壁开始逐渐皱缩(图6)，菌丝充满线虫体内，吸收线虫体内营养物质(图7)，直至虫体被完全消解(图8)。

图1 菌环萌发过程的显示(40×10)

图2 菌环上生长出的分枝(40×10)

图3 多个菌环形成菌网过程(40×10)

图4 形成的大面积菌网(20×10)

图5 菌环作用的线虫部位(前部)(40×10)

图6 死亡的线虫体壁皱缩(40×10)

图7 充满菌丝的线虫体(40×10)

图8 被完全消解的线虫(40×10)

3 讨论

D.flagrans和A.oligospora是目前世界上研究动物生防真菌公认的最具发展潜力的两种候选菌株[10]，二者在加入活的线虫三期幼虫后，均能很快产生菌环。本研究捕食性真菌D.flagrans在接种2 h后开始陆续出现菌环萌芽并慢慢闭合为完整菌环，4 h后即可大量形成菌环，菌网随之很快形成。另据报道，少孢节丛孢菌(A.oligospora)在接种幼虫5 h后，开始大量形成菌环，9 h后大量菌环相互连接成菌网。相比较而言，D.flagrans比A.oligospora产生菌环和菌网的时间都比较早，显示了不同菌种各自的特点。从相关试验来看，2种菌所产捕食器大小基本相近，捕食器菌丝一般均比普通菌丝粗壮。进一步观察发现，随着菌环和菌网的大量产生，虫体逐渐被捕获，而且D.flagrans捕获虫体的速度要快于少孢节丛孢菌。表明了捕食性真菌D.flagrans产生和形成捕食器的速度更快，显示了其更好的捕食线虫的效率和能力。

观察中发现被捕获的虫体部位多数为头颈部和尾部，且头颈部比尾部稍多，少数为身体的中部。这可能与虫体的运动方式有关，线虫在活动的时候，身体的头部和尾部活动性最强，可能最容易刺激菌丝特化形成捕食器。另外，也可能是由于在虫体的头颈部存在某种特异性的识别位点，这种受体与捕食器相互识别，导致捕食器与虫体相互吸引、靠近。当线虫被捕食器菌丝牢牢套住无法摆脱后，渐渐丧失活力直至死亡。线虫的死亡一方面是由于菌环的束缚，机械性致死。另一方面据资料报道[11]，捕食器菌丝能够产生胞外蛋白酶和凝集素，这些物质均具有毒性，参与了捕食性真菌捕获和致死虫体的过程。当菌丝穿透线虫体壁，向内部生长，不断充斥线虫整个身体大约4 d～5 d后，虫体被慢慢消解，只剩躯壳。有资料显示菌丝在伸入虫体内部可以消化其脂肪，吸收其营养物质和水分等。

本试验中马圆线虫在接种后4 h开始被捕获，24 h后即被真菌侵入致死，5 d后才被完全消化，这与徐春兰等[12]和胡黔林等[13]研究中D.flagrans对秀丽新杆线虫和捻转血矛线虫的捕食结果不同，其中秀丽新杆线虫在加入后0.5 h即可被捕获，4 h菌丝侵入体内致死，24 h被完全消化；而捻转血矛线虫在加入后20 h菌丝侵入虫体，直到24 h时虫体肠管破裂死亡，48 h时被完全消化，虫体的种类不同，其结构有差异，真菌对它们作用的时间也不尽相同，秀丽新杆线虫是非寄生性线虫，虫体无外鞘膜；而后者是寄生性线虫，体表多了一层外鞘膜，因此真菌进入其体内需要更长时间。

值得注意的是捕食性真菌在整个培养和观察试验过程中极易被污染，因此在捕食性真菌捕食线虫的动态过程观察中要尽量做到无菌，以免影响观察结果。另外，为了在光学显微镜下更好更清晰的观察其捕食过程，利用改进的玻片培养基进行培养和观察，实际应用表明效果比较好，便于进行拍照。在培养过程中，需保持玻片培养基适宜的湿度，以防止发生干裂，以确保捕食过程动态观察的顺利进行。

综上所述，本试验基本了解了捕食性真菌D.flagrans捕食器的形成及捕食线虫的动态变化过程，与已报道的捕食性真菌少孢节丛孢菌在捕食线虫三期幼虫时生物学特性的比较分析，更加证实了捕食性真菌D.flagrans在临床应用方面的价值和发展潜力。为进一步阐明捕食性真菌捕食机理提供了重要的科学参考依据。