生物活性肽功能及制备技术研究进展

2018-11-05 00:49余楠楠
中国酿造 2018年9期
关键词:蛋白酶水解产物

余楠楠,陈 琛*

(陕西理工大学 生物科学与工程学院,陕西 汉中 723000)

生物活性肽是由2个或2个以上氨基酸组成的具有特殊活性的肽类,分子质量一般<6 kDa,构成生物活性肽的氨基酸的组成及分子排列方式不同[3]。生物活性肽的制备方法包括酶水解法、化学水解法、微生物发酵法、化学合成法、基因重组法和多肽的提取分离纯化。

在有关生物活性肽的研究方面,国外已将其作为疫苗、诊断药物广泛应用于实践中。而我国起步较晚,在许多研究上仍处于临床前期的实验过程。本文综述了生物活性肽的种类和生物功能、生物活性肽的制备技术和分离纯化方法进行了概述,重点阐述了酶解法、微生物发酵法制备生物活性肽的技术方法。

1 生物活性肽的种类及其功能

1.1 抗氧化肽

抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂质氧化以及与金属离子螯合等能力,具有抗氧化作用[4]。抗氧化肽是维持人体抗氧化防御系统动态平衡的基础,可以抑制细胞氧化,减少许多因氧化产生的疾病。

HU F等[5]的研究中,用碱性蛋白酶水解山核桃蛋白分离物(pecan protein isolate,PPI)以产生抗氧化肽。利用动力学模型科学的解释了PPI的酶解过程,通过分子质量为10 kDa、5 kDa和3 kDa的截留膜超滤逐步分离PPI水解产物,体外评估抗氧化活性,成功纯化得到了最强的抗氧化剂部分(<3kDa)和新型抗氧化肽。纯化的抗氧化肽氨基酸序列为Leu-Ala-Tyr-Leu-Gln-Tyr-Thr-Asp-Phe-Glu-Thr-Arg。纯化部分的质量浓度在0.1 mg/mL时对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthi-azoline-6-sulphonate),ABTS]自由基,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羟基自由基的清除率分别为67.67%、56.25%、47.42%,具有显著的抗氧化活性。

1.2 血管紧张素转化酶抑制肽

高血压是在全球范围内备受关注的一种心血管疾病,不仅患病率高,还有可能引发冠心病、心肌梗塞以及肾功能衰竭等疾病[6]。目前临床上,高血压主要依靠化学药物进行治疗,但有较大的副作用且极易产生依赖性[2],因此研发天然具有降血压作用的生物活性肽引起人们诸多关注。

血管紧张素转化酶(angiotensin-Iconverting enzyme,ACE)是调节血压的一种重要的酶。当人体出现血压过高的情况时,可使用ACE抑制肽来降血压[7]。LIU C等[8]研究中,采用离子交换色谱,凝胶过滤色谱,反相高效液相色谱(reverse phasehigh-performanceliquid chromatography,RPHPLC)和液相色谱-电喷雾串联质谱(liquid chromatography coupled withelectrospray ionizationtandemmassspectrometry,LC-ESI-MS/MS)纯化和鉴定来自榛子的ACE抑制肽。鉴定出了3个新的ACE抑制肽Ala-Val-Lys-Val-Leu(AVKVL),Tyr-Leu-Val-Arg(YLVR)和Thr-Leu-Val-Gly-Arg(TLVGR),半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值分别为73.06μmol/L,15.42μmol/L和249.3μmol/L。3个新的ACE抑制肽通过非竞争模式抑制ACE活性。AVKVL,YLVR和TLVGR对ACE的结合自由能分别为-3.46kcal/mol,-6.48 kcal/mol和-7.37 kcal/mol。YLVR对ACE的强烈抑制可能归因于阳离子-π相互作用的形成。

LIAOP等[9]将鳖甲用六种不同蛋白酶水解,木瓜蛋白酶制备的水解物比其他酶水解物对血管紧张素I转换酶(ACE)具有更强的抑制活性。通过超滤,凝胶过滤色谱,离子交换柱色谱和高效液相色谱连续纯化两种非竞争性ACE抑制肽,其氨基酸序列分别为Lys-Arg-Glu-Arg和Leu-His-Met-Phe-Lys,IC50值分别为324.1μmol/L和75.6μmol/L,证实鳖甲是具有ACE抑制活性的活性肽的潜在来源。此外,酶动力学和等温滴定量热法分析表明,与Lys-Arg-Glu-Arg相比,Leu-His-Met-Phe-Lys与ACE形成更稳定的复合物,具有更好的抑制活性。TUM等[10]从酪蛋白水解产物中不断鉴定出各种生物活性肽,通过超高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱(ultraperformanceliquid chromatography-electrospray ionization-quadrupoletimeof flightmass spectrometry,UPLC-ESI-Q-TOF-MS)联用技术筛选和鉴定了一种新的血管紧张素I转换酶抑制性肽Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu-Cys-Ser-Thr-Phe-Cys-Lys,该肽来源于αs2-酪蛋白片段残基25-41,通过高效液相色谱方法测定的肽的IC50值为129.07μmol/L。

1.自主创新条件逐步改善。国家把自主创新作为发展战略,建立创新型国家,是要建立以企业为主体、市场为导向和产学研相结合的技术创新体系,使企业真正成为研究开发投入的主体、技术创新的主体和创新应用成果的主体,全面提升企业的自主创新能力。我国的养猪业已逐步把自主创新能力放在行业发展的优先地位上来,紧紧围绕养猪服务于经济建设这个中心任务,着力解决制约养猪生产的重大科技问题,大幅提高行业竞争力。

1.3 抗菌肽

抗菌肽对真菌、细菌、病毒等有良好的抑制作用。如今抗生素的滥用引发许多安全问题,细菌耐药性增强以及大量的药物残留迫使人们研究出安全无副作用的抗菌剂。抗菌肽具有抗菌活性强且不易产生耐药性的优点,为抗菌新药的研发提供了方向。

BAOY等[11]的研究中,使用凝胶过滤色谱法纯化了两种类型的泥蚶血红蛋白Tg-HbI和Tg-HbII,并且测量了它们的抗菌和过氧化物酶活性。结果显不,泥蚶血红蛋白可能通过天然分子的过氧化物酶活性和从蛋白质释放的一些内部肽发挥宿主抗菌防御的作用。

章检明等[12]利用琼脂扩散法筛选产抗菌肽的菌株,运用细胞吸附解吸和阳离子交换层析法纯化抗菌肽,筛选出的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)4121所产生的抗菌肽热稳定性及酸稳定性良好,具有广谱抑菌能力。

1.4 抗肿瘤肽

目前,癌症已成为危害人类健康的一大疾病,其发病率与死亡率极高,人们对癌症的预防和治疗尤为重视。与传统的化疗药物相比,抗肿瘤生物活性肽具有特异性强,毒副作用小,不易产生耐药性等优点[13],是抗肿瘤药物研究开发的热点。

抗肿瘤肽有许多来源,如牛奶,奶酪,大豆,蛋和软体[14]。王楠等[15]采用Sephadex G-25凝胶柱层析分离,得到I,II,III,IV,V 5个抗肿瘤肽组分。再以不同质量浓度(6.25~100μg/mL)的甲鱼碱溶蛋白肽处理人肺癌A549细胞24 h。结果显不,肽组分I,II,III,IV对人肺癌A549细胞有不同程度的抑制,且活性存在很大的差异。其中肽组分I的抗肿瘤活性最高,对A549细胞的最高抑制率均超过了60%,有很好的量效关系,半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)为32.26μg/mL。由此可判断肽组分I在体外具有较好的抗肿瘤作用。

1.5 免疫调节肽

免疫调节肽具有促进和调节免疫功能的作用,是一种功能性化合物,在机体中起到重要的免疫调节作用。免疫是机体自身的免疫系统识别异己,产生免疫应答排除异物的一种机体自我保护。具有免疫调节功能的生物活性肽包括寡肽、多肽和一些蛋白酶水解的混合肽[16]。

邓志程[17]的研究中采用模拟消化酶水解法制备马氏珠母贝全脏器免疫活性肽,同时探究了制备的马氏珠母贝全脏器免疫活性寡肽对小鼠免疫活性的影响。结果表明,小鼠淋巴细胞的转化能力显著增强,小鼠的免疫应答能力显著提高。

LOZANO-OJALVO D等[18]研究肽的免疫调节作用,以及卵清蛋白,溶菌酶,卵类粘蛋白和全蛋清碱性蛋白酶水解产物对细胞因子的产生、抗体分泌,以及用T(伴刀豆球凝集素A,concanavalin A,con-A)或B细胞有丝分裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的鼠脾和肠系膜淋巴结细胞的增殖的作用。结果表明,卵清蛋白、溶菌酶和全蛋清的碱性蛋白酶水解产物降低了con-A刺激的淋巴细胞增殖和Th2偏向白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)和IL-10的分泌,并减少了Th1细胞因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的产生。可降低因产生促炎细胞因子和细胞毒性物质对细胞的影响,增加细胞的免疫调节作用,酶水解全蛋白释放的肽可以以不同方式调节小鼠细胞对有丝分裂原刺激的免疫反应。

2 生物活性肽的制备技术

2.1 酶解法

酶解法制备生物活性肽具有较低的生产成本、较高的产品安全性、温和的生产条件、易于控制进程等特点[19],故酶解法成为制备生物活性肽最常用的方法之一。表1列举了采用酶解法从不同的原料中制备生物活性肽的条件、方法和功能活性。

表1 酶解法制备生物活性肽Table1 Bioactive peptides preparation by different raw materials hydrolysis

酶解法中蛋白酶的种类有很多,几种常见的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等。蛋白酶催化蛋白质中肽键的水解时,因水解条件(pH、温度、时间等)不同会影响多肽链的长度、氨基酸顺序和游离氨基酸的数量,从而影响水解产物的生理活性[29]。

WU Q等[23]使用胃蛋白酶,胰蛋白酶和β-胰凝乳蛋白酶水解蚕蛹蛋白质,并通过超滤,凝胶过滤层析和反相高效液相色谱依次纯化水解产物。结果显不,鉴定出一种新型的ACE抑制肽Ala-Ser-Leu,具有很强的ACE抑制活性,IC50值为102.15μmol/L。表明蚕蛹蛋白水解物可作为高血压治疗产品开发。唐蔚等[30]利用大孔吸附树脂对南瓜籽抗氧化肽进行分离纯化。结果显不最优的条件是:碱性蛋白酶、酶解pH=10.1、温度52℃、时间120 min、底物浓度5.7%、加酶量2%,此条件下抗氧化性最为显著。

在制备生物活性肽的方法中,优先使用的方法便是酶水解法,尤其是在食品和药物中,因为其最终产物中残留的有机溶剂和有毒物质较少。而且酶水解是一种在温和条件下进行的方法,酶解条件很容易控制。通过将反应介质调节到酶的最佳pH和温度,可以在连续的酶促反应中使用多种酶进行水解[31]。在工业生产中,纯化成本较高限制了高纯度生物活性肽的生产,可用固定化酶进行水解生产多肽,固定化酶允许在更温和更受控制的条件下进行酶促水解,可以实现连续生产,而且固定化酶可回收,避免了酶产生次级代谢产物,产物易于分离纯化。

2.2 微生物发酵法

与酶解法相比,微生物发酵法产物纯化困难,有很多产酶菌株对机体产生毒害、效率低、安全性低等限制了该法的应用[32]。

NIU L Y等[33]利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1发酵制备脱脂小麦胚芽肽(defatted wheat germ peptides,DWGPs),并研究DWGPs的抗氧化活性。结果显不,发酵制备的DWGPs表现出对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基清除活性的作用,表明脱脂小麦胚芽肽可作为食品工业中有前景的抗氧化物质。JAIN S等[34]利用乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)发酵鸡蛋壳膜,在初始pH 8.0条件下培养36 h获得水解产物。发酵产生的水解产物具有优异的溶解度(90.7%),良好的发泡能力(36.7%)和乳化活性(94.6 m2/g)。这些产物表现出显著的抗氧化活性、降高血压活性、抗菌活性,可作为功能性食品的添加剂。

部分菌株微生物发酵法制备生物活性肽的条件和方法见表2。

表2 微生物发酵法制备生物活性肽Table2 Bioactive peptides preparation by different microbiological fermentation

2.3 其他制备方法

化学合成法目前在实验室应用较为广泛,可分为液相合成法和固相合成法[43]。液相合成法可较好的合成小分子肽浓缩多肽片,固相合成法的固相载体对合成中肽链的固定、环化、去保护和纯化较为有利,但成本高,副反应和残留化合物多,限制了大规模生产。

蛋白质的化学水解法包括酸水解和碱水解。此方法因成本低和操作简单而广泛应用于工业,其缺点是水解过程难以控制,使用酸碱试剂对氨基酸的损害较为严重。

基因工程重组法生产多肽技术已经趋于成熟,具有不受生产原料限制表达定向性强等优点,但其仅限于大分子肽的合成,表达短肽链较为困难,且具有表达效率低等问题[43]。

2.4 产物分离与纯化

生物活性肽的分离纯化技术对生物活性肽的下一步研究应用以及构效关系确定非常重要。常用的分离纯化技术有:色谱技术、电泳技术、膜分离技术。已经在制备生物活性肽中得到广泛应用的色谱技术有大孔树脂吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换树脂层析、反相高效液相色谱等分离方法。多肽的分离纯化非常复杂,使用单独一种方法很难得到纯品,而使用多种方法联用来分离多肽可以提高多肽的纯度和活性,但是产率较低。

邓志程等[44]以马氏珠母贝为原材料制备酶解液,利用Sephadex G-25凝胶柱层析、Capto Q强阴离子交换色谱等来分离纯化和筛选马氏珠母贝多肽酶解液,获得2个免疫活性肽。

3 总结与展望

生物活性肽因来源广泛、功能多样,安全性高、价格低廉、特异性强等多种优势而受到越来越多国内外研究学者的关注,生物活性肽产品开发具有较好的前景。目前生物活性肽产品较少,已上市产品价格昂贵,虽然生物活性肽的制备及分离纯化技术得到了迅速发展,但是仍然存在一定的问题,色谱纯化产品收率低,精制成本高,导致产品价格昂贵,影响后端产品销售,非精制产品杂质多,功效低,还会存在过敏原等。水解法制备生物活性肽还存在水解率低、原料的利用率较低等问题。但是相信随着生物活性肽生产技术方法的发展和生产设备的不断进步,生物活性肽的深加工品必将会应用到功能食品、医药、化妆品等多个领域。

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