血管腔内成形术治疗对糖尿病足患者创面肉芽组织VEGF/VEGF-R2/SRC表达的影响

王明利，冯琦，贾一松，马武勃，刘亚民

糖尿病足（DF）是糖尿病的严重并发症之一，在世界范围内有着极高发病率[1]。糖尿病足患者的皮肤伤口愈合缓慢，严重者可能需要截肢，给患者健康造成严重威胁[2]。糖尿病可改变患者的血管生成，白细胞浸润，巨噬细胞功能，细胞外基质沉积和成纤维细胞转化等生物学过程，对伤口愈合的各个阶段（凝血，炎症，再上皮化和重塑）都产生一定的影响[3,4]。尽管创面愈合的过程十分复杂，但是调控血管内皮生长因子（VEGF）等多种生长因子，恢复血运重建是目前糖尿病足治疗的重要手段[5,6]。

糖尿病足患者创面肉芽组织愈合过程中，血管生成起着关键作用。多种信号通路被VEGF，血小板衍生生长因子，血管生成素，Notch，Wnt和转化生长因子-β等细胞因子激活，其中又以VEGF作为主要参与者[7]。VEGF-A是血管生成的主要介质，主要激活酪氨酸激酶受体VEGF受体-2（VEGFR-2）。而非受体酪氨酸激酶SRC（一种膜结合的非受体酪氨酸激酶）则是上述几种生长因子受体的信号转导的重要下游，其转导途径包括磷脂酰肌醇-3-激酶，粘着斑激酶和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），对血管生成调控具有重要意义[8]。

经皮血管腔内球囊扩张成形术联合支架置入术是已经被广泛应用于糖尿病足大血管重建的治疗方法，但其对VEGF等血管生长因子的影响还不明确，为探究血管腔内成形术对VEGF/VEGF-R2/SRC功能轴的影响，协助术后疗效的预测和评估，我科自2015年1月～2017年12月采用经皮血管腔内球囊扩张成形术联合支架置入术治疗糖尿病足患者，观察其疗效，血管腔内成形术治疗对糖尿病足患者创面肉芽组织VEGF/VEGF-R2/SRC表达的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组选择2015年1月～2017年12月于宝鸡市中医医院确诊为糖尿病足的患者137例，其中男性69例，女性68例，年龄38～75（42.3±6.1）岁。所有患者依据WHO制定的诊断标准[9]确诊为2型糖尿病，患者均以足部感染或溃疡不愈为主要症状来院就诊，并伴不同程度的足部皮肤麻凉、疼痛、间歇性跛行等症状，各类检查证实患肢动脉有变形、狭窄或闭塞，血流速度减慢。本研究征得患者及其家属同意，经本院医学伦理委员会审批通过实施。将患者随机分为手术组69例和对照组68例。手术组男性36例，女性33例；年龄43～74（53.1±11.2）岁；糖尿病病程3.4～22.6（16.8±3.9）年；糖尿病足病程23～248（52.6±15.3）d；Wagner分级：Ⅰ级23例，Ⅱ级22例，Ⅲ级18例，Ⅳ级6例；对照组男性34例，女性34例；年龄45～74（53.7±11.3）岁；糖尿病病程2.9～23.1（16.1±5.1）年；糖尿病足病程32～254（51.6±14.2）d；Wagner分级：Ⅰ级21例，Ⅱ级20例，Ⅲ级19例，Ⅳ级8例。两组患者一般资料比较无明显统计学差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法对照组患者严格执行糖尿病饮食和胰岛素降血糖、采集病变部位分泌物病原菌培养，根据药敏结果选择有效抗生素控制感染，局部清创及换药等常规治疗；手术组在对照组治疗方法的基础上，采取经皮腔内球囊扩张形成术联合支架置入术的治疗方法，局麻成功后，经股动脉顺行或胫后动脉逆行穿刺，成功后造影显示病变动脉，注入肝素钠3000 u，导丝穿过闭塞或狭窄动脉，以球囊进行扩张，若扩张后血管开通率＜70%，则置入金属支架。膝关节以下病变动脉只采取球囊扩张，不进行支架置入治疗。

1.2.2 创面愈合率测定患者于入组时、治疗第2、4周，对足背创面拍照，测定创面面积，计算创面愈合率。愈合率（%）=（1-目前创面面积/入组时创面面积）×100%。

1.2.3 患肢血管功能测定患者于入组时及治疗第4周后，以彩色多普勒超声诊断仪检测治疗前后内膜中层厚度、收缩期血管峰值血流速度、静息状态下血管管径（D0）、充盈状态下血管管径（D1），并计算弹性程度（D1-D0）/D0。

1.2.4 创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC含量测定两组患者于治疗4周后采用免疫组织化学染色检测创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC含量，石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、PBS洗涂（1 min×3次）、滴加VEGF/VEGF-R2/SRC（1:25）过夜，孵育，PBS清洗等操作均按照试剂盒说明书进行。镜下棕黄色和棕褐色颗粒即为阳性细胞。采用Image-Pro Plus 5.0进行测量，分析图中累计光密度值（IOD）。

1.2.5 创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC基因表达采用Real-time PCR检测，于治疗4周后提取两组患者创面肉芽组织细胞总RNA、逆转录合成cDNA后行Real-time PCR监测，严格按试剂盒说明进行操作。引物序列VEGF: 上游5’-ATG AACTTTCTGCTGTCTTGGGT-3’，下游5’-AT CATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3’；VEGFR-2: 上游5’-TACACGCAGTTGCAGTACATCG-3’，下游5’-CGCAGGATCTGGTAGAGGAAGT-3’；Src：上游5’-GAGCGGCTCCAGATTGTAA-3’，下游5’-CTGGGGATGTAGCCTGTCTGT-3’；以GAPDH为内参，引物序列：5’-CAATGACCCCT TCATTGACC-3’，5’-TGGAAGATGGTGATGG GATT-3’。反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，40个PCR循环；绘制熔解曲线。以2-△△CT值法进行相对定量分析，以目的基因初始模板相对量与GAPDH初始模板相对量的比值表示VEGF、VEGF-R2、SRC的表达水平。

1.3 统计学处理所有数据应用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者创面愈合率比较与对照组相比，手术组治疗后第2、4周时创面愈合率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2 两组患者治疗前后下肢血管功能比较手术组与对照组患者治疗前内膜中层厚度、收缩期血管峰值血流速度、（D1-D0）/D0等指标无明显差异（P＞0.05）。治疗后两组患肢血管功能均较治疗前明显改善（P＜0.05），手术组较对照组疗效更为明显，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表1 两组患者创面愈合率比较

表2 两组患者治疗前后下肢血管功能比较（x±s）

2.3 两组患者创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC含量比较治疗4周后手术组创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC含量（IOD值）较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 两组患者创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC含量比较

2.4 两组患者创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC基因表达比较治疗4周后手术组创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC表达较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图2），基因表达结果与免疫组化相一致。Pearson相关分析发现，SRC基因表达与VEGF-R2表达正相关（r=0.541，P＜0.05）。

图2 两组患者创面肉芽组织VEGF、VEGF-R2、SRC基因表达对比

3 讨论

糖尿病周围神经病变是糖尿病最隐匿，它影响着超过50%的糖尿病患者。糖尿病足在糖尿病患者中的发病率约为10%，糖尿病血管病变包括动脉炎和小血管血栓形成；缺血引起的神经病变和大血管动脉粥样硬化，三者叠加极易造成承重部位受累，引发糖尿病足溃疡[10]。改善患足局部缺血对于促进糖尿病足溃疡恢复具有重要意义，经皮腔内球囊扩张形成术联合支架置入术是常用的改善下肢动脉血运的血管性介入治疗手段。本研究发现，血管腔内成形术治疗较对照组患者创面愈合率明显提高，下肢血运功能明显改善，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明血管腔内成形术对于促进创面组织愈合，扩张血管，改善局部血液循环有重要意义。

糖尿病足具有慢性创伤的所有特征，伤口愈合是一个复杂，动态和有序的控制过程，其中血管生成或新血管形成通过滋养新形成的组织来起到关键的病理生理学作用[11]。伤口愈合过程始于炎症反应，然后是新的组织和肉芽生成，募集和血管生成的内皮细胞生长。 PDGF，VEGF及其受体和TGF-β在这些过程中起关键作用，其中VEGF是血管生成的关键刺激因子，可诱导血管内皮细胞的有丝分裂和迁移，并且其受体具有酪氨酸激酶活性，直接调控内皮细胞膜中的Ca2+通道开放[12]。有证据表明，糖尿病患者组织中VEGF的浓度降低，而VEGF在激活和指导伤口愈合的各个阶段都是不可或缺的，具体而言，VEGF可诱导生产性细胞向受伤区域迁移；引导细胞外基质积聚，促进起始血管的生成和成熟，刺激肉芽组织生长；还可促进成纤维细胞活化和增殖，刺激伤口收缩[13]。本研究中发现，创面肉芽组织VEGF含量在腔内血管成形术后显著提高，明显高于对照组。说明血管腔内成形术可以有效的恢复创面VEGF表达，改善伤口愈合的各阶段的VEGF不足，这可能是术后创面愈合速率较快的机制之一。

VEGF通过结合跨膜受体（如VEGFR1和VEGFR2）发挥其生物学功能，两者都在内皮细胞表面特异性表达，并含有胞质酪氨酸激酶结构域。VEGF通过与其两种受体酪氨酸激酶VEGF-R1和VEGF-R2在血管内皮细胞上相结合，发挥调控血管生成的作用[14]。目前的研究表明，VEGF-R2似乎介导大多数已知的对VEGF-A的细胞应答，在肿瘤血管生成过程中，VEGF介导的血管生成作用可能是SRC依赖的[15]。因此我们研究了血管腔内成形术对SRC的影响，结果表明SRC在血管腔内成形术后的表达亦明显增加，而其对血管生成的具体机制还需进一步研究，SRC的调控作用可能与MAPK信号通路有关，在SRC作用下Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活可能是术后肉芽组织愈合加快的重要原因[16]。另外，VEGF-R2与SRC的表达正相关，作为VEGF的下游信号分子，VEGF-R2与SRC在对血管腔内成形术的疗效评价方面可能有其独特的意义，但具体相关性有待大样本多中心数据进一步证实。

综上所述，经皮血管腔内球囊扩张成形术联合支架置入术治疗可有效的促进糖尿病足患者创面愈合，改善患肢血运功能。而其对创面愈合的促进作用可能是因为创面肉芽组织VEGF/VEGF-R2/SRC轴的表达增加。术后VEGF及其下游VEGF-R2/SRC在创面肉芽组织乃至血清中的表达变化检测，可能为糖尿病足患者经皮血管腔内球囊扩张成形术联合支架置入术的疗效评估以及预后分析提供依据。