固相萃取-高效液相色谱法在食品中合成着色剂检测中的应用

□ 赵 俊 刘 虹 楚雄彝族自治州食品药品检验所

很多生产厂家为了满足人们在感官上对食品的需求，而在食品中添加大量的食品合成着色剂，严重违反了国家对合成着色剂使用种类还有使用量的规定，实施非法添加合成着色剂，影响人们的生命安全。就拿配制酒制作来说，为了谋取暴力经济效益，我国在制作配制酒的时候大量掺杂合成着色剂，生产了大量假酒。针对合成着色剂滥用的恶劣现象，需要采取科学合理的方法，对合成着色剂进行检验，使产品符合安全要求。

1 检测设备和试剂

①实验设备：高效液相色谱仪（Thermo Scientific Ultimate 3000）；由上海安谱公司提供的500 mg/3 mL 的聚酰胺 SPE 固相萃取小柱；睿科全自动固相萃取仪；涡旋仪以及氮吹仪。②样品：干红配制酒。③试剂：柠檬黄、日落黄、胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝标准品，厂家均 为 Stanford Analytical Chemicals公司，甲醇色谱纯、甲酸分析纯、氨水分析纯、乙酸铵色谱纯。④制作标准储备液：准确称取柠檬黄、日落黄、胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝各0.1 h 于100 mL容量瓶中，加水到刻度。配制得浓度为 1 000 mg/L 的标准储备液；配制混合标准工作液：分别取已经制作成功的各种合成着色剂标准储备液 1 mL 于 100 mL 的容量瓶中，以水定容，最终配制成为浓度10 mg/L的混合标准工作液。

2 合成着色剂实验检测方法

2.1 样品进行预处理和净化

配制酒的成分复杂，基质干扰大，含有一些食品添加剂如防腐剂、合成着色剂、食用香精、酸度调节剂，以及天然色素、糖类、有机酸类等成分，不经净化直接进样对待测成分的测定干扰大，并且还会污染色谱柱，降低柱子的使用寿命。按照国标GB/T 5009.35-2016中的处理方法，采用聚酰胺粉吸附，用G3垂融漏斗抽滤的净化方法，操作不方便，重现性和回收率都不是很理想，而且不适合大批量样品同时处理，不易做自动化方法移植。

针对本试验中选取样品配制酒，选用聚酰胺柱SPE固相萃取小柱，用以吸附食品中的合成着色剂，选用氨化甲醇洗脱，浓缩时间短，适用于实验室大批量样品的同时处理。配制酒样品直接进行固相萃取，然后先用5 mL的甲醇活化聚酰胺小柱，再用5 mL的水进行再次活化。选取5 mL样品上清液上柱，用3 mL配制体积比例为2∶2∶6的甲醇-甲酸-水溶液淋洗萃取柱，流速控制在1.5～2 mL/min，等到所有流出液被去除后进行真空抽干，再用7 mL浓度10%的氨水-甲醇溶液进行洗脱，最后收取洗脱液，用40 ℃的氨气吹干，再与1 mL的水混合均匀，经过0.45 μm滤膜过滤，最后将过滤后的净化处理样品进行液相分析。

2.2 进行高效液相色谱检测合成着色剂需要具备的色谱条件

选用的色谱柱，规格250 mm×4.6 mm， 序 号 SN 498533 ，Agilent 5 TC-C18（2）C18柱；流动相，甲醇和浓度为0.02 mmol/L的乙酸铵溶液；进样量，20 μL。梯度洗脱程序：①体积比为10∶90的甲醇和乙酸铵溶液洗脱不超过1 min；②体积比为20∶80的甲醇和乙酸铵溶液洗脱3 min；③体积比为70∶30的甲醇和乙酸铵溶液洗脱7 min；④体积比为10∶90的甲醇和乙酸铵溶液洗脱7 min；⑤体积比为10∶90的甲醇和乙酸铵溶液洗脱11 min；流速控制在 1 mL/min，柱温度控制在25 ℃，检测器使用二极管阵列检测器，3D扫描。进行色谱分析，处理波长时：柠檬黄428 nm、日落黄485 nm、胭脂红510 nm、诱惑红510 nm、苋菜红520 nm、亮蓝 630 nm。

3 色谱检测结果及分析

3.1 最优色谱检测条件

（1）按照通常的研究来说，实验中的6种合成着色剂在254 nm的波长条件下能够最大吸收，但在实际操作中，此波长度会存在多种物质吸收，导致许多干扰峰出现，抬高色谱基线（图1），并不是合适的色谱检测波长。而在各种合成着色剂可见光区最大吸收波长下检测，虽然会在一定程度上弱化对标准信号的收集，但是能够有效避免杂质，增加检测灵敏度（图2）。

（2）根据流动相比例调整确定梯度洗脱标准条件。针对不同的合成着色剂分别在不同时刻不同波长条件下扫描3D光谱结果，绘制标准品液色谱图，如图3所示。在这样的条件下，各着色剂能够很好地分离。

3.2 样品净化

通过研究可以发现，就算在各种合成着色剂可见光区最大吸收波长下收集色谱信号也会产生基质干扰，如图4所示，需要实施进一步净化。针对本试验中选取的基质干扰比较中的食品样品——配制酒，需要用聚酰胺柱进行净化。配制酒样品直接进行固相萃取，然后先用3 mL的甲醇活化聚酰胺小柱，再用3 mL的水进行再次活化。选取5 mL样品上清液上柱，用3 mL配制体积比例为2∶2∶6的甲醇-甲酸-水溶液淋洗萃取柱，流速控制在1.5～2 mL/min，清除大部分的干扰杂质，然后再用氨水-甲醇溶液进行解吸，最后将收集到的洗脱液进行氮吹定容。经过固相萃取净化的液相色谱图，如图5所示。

图1 254 nm波长条件下，样品的液相色谱图（AU）

图2 样品在可见光区最大吸收波长下检测得到的液相色谱图（AU）

图3 标准样品液相色谱图（AU）

图5 固相萃取净化后的液相色谱图（AU）

图4 白葡萄酒样品可见光区最大吸收波长条件下的液相色谱图（AU）

可以对比图4、5，样品经过固相萃取后，净化程度得到一定提高，得到的液相色谱图已经少了很多杂质干扰。但是，还是存在一定的基质干扰，还需要采取更加先进的处理方法进一步净化，液相色谱检测需要进一步优化。

3.3 利用固相萃取-液相色谱法检测合成着色剂的回收率

将合成着色剂的混合标准溶液稀释成为不同浓度的标准溶液，然后在3个标准量水平，几点检测低限、2倍检出限、10倍检出限下进行6次进行合成着色剂回收率检测实验，具体结果见表1。

由表1可知，反复进行液相色谱检验着色剂回收率检验，表现性好。

4 实验结论

采用固相萃取-高效液相色谱法检测合成着色剂，经过科学的样品提取、净化，检测时要注意使用聚酰胺柱净化，在各种合成着色剂光区最大吸收波长下进行信号收集，最大程度避免杂质干扰，提高着色剂的检验灵敏度。本实验检验方法有利于快速高效地检验人工合成着色剂，值得推广。

表1 固相萃取-液相色谱法检测合成着色剂的回收率结果