妊娠后期饲粮中添加小麦水解蛋白对母猪繁殖性能、血清生化指标和氨基酸含量及胎盘组织营养物质转运相关基因表达的影响

寇 娇 梁海威 刘 宁 戴兆来 李 菊 潘俊良 朱芳周 伍国耀,4 武振龙*

(1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.河南银发牧业有限公司，郑州 451100；3.郑州新威营养技术有限公司，郑州 450100；4.德克萨斯州农工大学动物科学院，大学城 77843)

小麦是我国最主要的粮食作物之一，其蛋白质、氨基酸和矿物质等含量丰富。除食用外，小麦还是重要的能量饲料原料。随着国内玉米价格的上涨，小麦及其副产品由于具有营养价值与玉米相近、价格相对平稳等优势在饲料工业中的应用逐渐增多。小麦蛋白(也称谷朊粉、活性面筋粉)是小麦淀粉生产过程中的主要副产物，由麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、麦清蛋白和麦球蛋白组成，前2种蛋白质组分约占小麦蛋白的90%[1]。小麦蛋白特殊的结构造成其水溶性低、黏性大，因而限制了其在饲料中的添加和应用[2-3]。近年来，随着生物酶解技术发展，以小麦蛋白为原料经复合酶解加工工艺制备而来的水解产物[也称小麦水解蛋白(hydrolyzed wheat gluten,HWG)、小麦水解活性肽等]提高了其可溶性与消化率，并且含有多种活性小肽，推动了其在饲料工业中的应用。

HWG的蛋白质含量约为80%，富含多种氨基酸和小肽，如谷氨酰胺、谷氨酸和亮氨酸，其中谷氨酰胺约占氨基酸总量的30%[4-5]。谷氨酰胺和谷氨酸是猪肠道发育的重要能量底物和信号分子。饲粮中67%左右的谷氨酰胺和97%左右的谷氨酸在小肠被分解利用，维持小肠上皮细胞的增殖与更新，保障肠黏膜的屏障功能和肠上皮细胞间紧密连接蛋白的表达[6]。前期的研究发现，饲粮中添加1%谷氨酰胺能够提高血浆中谷氨酰胺含量，改善断奶仔猪小肠绒毛结构，提高上皮细胞间紧密连接蛋白的表达，减少肠上皮细胞通透性[6-7]。谷氨酰胺调节紧密连接蛋白表达主要是通过钙调素依赖蛋白酶[8]。同时谷氨酰胺、谷氨酸能够缓解氧化应激引起的猪肠上皮细胞凋亡，维持肠上皮屏障功能[9]。亮氨酸是机体重要的必需氨基酸，约占机体氨基酸的7%。饲粮中补充亮氨酸能够促进仔猪肠绒毛发育，促进蛋白质合成和氨基酸转运载体的表达，提高仔猪的生长性能[10]。

HWG作为一种优质的植物性蛋白质，在欧洲等国家广泛应用于乳仔猪教槽料、水产料、犊牛代奶粉及宠物饲料[11]。断奶仔猪饲粮中添加HWG可显著提高断奶仔猪平均日增重，降低料重比和腹泻率，提高空肠绒毛长度并显著降低隐窝深度，从而缓解断奶应激造成的肠黏膜损伤和生长受阻等影响[12]。HWG可部分替代鱼粉，从而降低饲料成本[13]。妊娠后期胎儿及乳腺快速发育、母猪体内激素和营养物质代谢急剧变化，其营养状况对胎猪生长性能和繁殖性能有重要影响。到目前为止，HWG在母猪饲粮中的研究还鲜有报道。因此，本试验通过在母猪妊娠后期饲粮中添加HWG，研究其对母猪繁殖性能、血清生化指标和氨基酸含量及胎盘组织营养物质转运相关基因表达的影响，为其在母猪生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的HWG由郑州新威营养技术有限公司提供，其氨基酸组成见表1。

表1 HWG的氨基酸组成

1)实测值。Measured values.2)蛋白质水解后天冬酰胺以天冬氨酸的形式被检测。The asparagine was determined as aspartate in protein hydrolysate.3)蛋白质水解后谷氨酰胺以谷氨酸的形式被检测。The glutamine was determined as glutamate in protein hydrolysate.

1.2 试验动物、分组与饲养管理

选用3～4胎次、预产期相近的妊娠第90天的大白母猪33头，其随机分为3组，每组11个重复，每个重复1头母猪。参考NRC(2012)标准配制妊娠母猪基础饲粮，对照组母猪饲喂基础饲粮，试验组母猪在基础饲粮中于妊娠第90～114天期间分别添加1%和2%的HWG，所有饲粮均以丙氨酸和玉米淀粉进行等能等氮，并平衡必需氨基酸。试验饲粮组成及营养水平见表2。试验期间每日饲喂2次(06:00和14:00)，饲喂量为kg/d，预产期前1周将试验母猪转入彻底消毒的产房，其余按猪场日常管理程序进行饲养管理。

表2 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 8 550 IU，VB10.11 mg，VB23.2 mg，VB120.017 mg，VD11 544 IU，VE 34.6 IU，生物素 biotin 0.172 mg，叶酸 folic acid 1.58 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 18 mg，烟酸 nicotinic acid 25 mg，Cu (as copper sulfate) 13.2 mg，Fe (as ferrous sulfate) 120 mg，Mn (as manganese sulfate) 70 mg，Zn (as zinc sulfate) 68 mg，I (as potassium iodide) 1.84 mg，Se (as sodium selenite) 0.4 mg。2)消化能为计算值，其余为实测值。DE was a calculated value, while the others were measured values.3)粗蛋白质包括饲粮中添加的丙氨酸和HWG。CP included the alanine and HWG added to the diet.4)饲料水解后谷氨酰胺以谷氨酸的形式被检测。Glu was determined as glutamate in feed hydrolysate.

1.3 指标测定

1.3.1 母猪繁殖性能测定

在母猪分娩结束4 h内，记录每头母猪的总产仔数、产活仔数、死胎数、仔猪初生窝重和初生活仔窝重，并计算仔猪平均初生重和平均初生活仔重。

1.3.2 血清生化指标的测定

于母猪妊娠第107天，每组随机选取6头母猪，采集前腔静脉血；母猪分娩时，每组随机选取6头母猪，采集脐带血。血样室温静置1 h后，3 000×g离心10 min，取上清液于-20 ℃保存，用于血清生化指标检测分析。

1.3.3 血清游离氨基酸含量的测定

高效液相色谱(HPLC)测定血清中的游离氨基酸含量，样品前处理：将血清样品从-20 ℃取出，冰上溶化，取20 μL血清样品于1.5 mL离心管；加入80 μL 1.5 mol/L HClO4除去血清中蛋白质，振荡混匀，4 ℃静置30 min；加入40 μL 2 mol/L K2CO3调节溶液pH，振荡混匀；14 800 r/min离心10 min，取50 μL上清液于1.5 mL离心管，用HPLC水稀释3倍；取50 μL稀释后样品、50 μL 1.2%苯甲酸和700 μL HPLC水于HPLC自动进样瓶中混匀，于HPLC仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)测定。

1.3.4 胎盘组织营养物质转运相关基因表达的测定

母猪自然分娩排出胎盘时，采集胎盘绒毛膜样品于-20 ℃保存。胎盘组织样品采用TRIpure试剂盒(艾德莱生物科技有限公司，北京)提取mRNA，通过核酸蛋白测定仪(IMPLEN，德国)测定各样品总RNA浓度，反转录得到cDNA(天根生化科技有限公司，北京)，通过实时荧光定量PCR法(7500 Real-Time PCR，Applied Biosystems，美国)检测目的基因的表达，基因引物序列见表3。反应体系为10 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)，2×SuperReal Premix 5 μL，Rox染料0.2 μL，ddH2O补齐至10 μL。反应程序如下：1)95 ℃预变性15 min；2)PCR反应：95 ℃变性10 s，60 ℃退火32 s，循环40次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行目的基因mRNA相对表达量的计算[14]。

表3 基因引物序列

1.4 统计分析

试验数据采用SAS 9.1.3软件中one-way ANOVA程序进行方差分析，GraphPad Prism 6.0软件作图。结果用平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 妊娠后期饲粮中添加HWG对母猪繁殖性能的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加1%HWG显著提高了仔猪平均初生活仔重(P<0.05)；饲粮中添加2%HWG显著提高了仔猪初生

窝重和初生活仔窝重(P<0.05)。饲粮中添加HWG对窝产仔数、窝产活仔数、死胎数、平均初生重无显著影响(P>0.05)。

2.2 妊娠后期饲粮中添加HWG对母猪和脐带血清生化指标的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮中添加1%HWG显著降低了妊娠第107天母猪和脐带血清中血氨含量(P<0.05)；饲粮中添加2%HWG显著提高了脐带血清中白蛋白、葡萄糖含量和碱性磷酸酶活性(P<0.05)，显著降低了母猪和脐带血清中血氨含量(P<0.05)。

表4 妊娠后期饲粮中添加HWG对母猪繁殖性能的影响

同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。In the same row, values with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表5 妊娠后期饲粮中添加HWG对母猪和脐带血清生化指标的影响

2.3 妊娠后期饲粮中添加HWG对母猪和脐带血清中氨基酸含量的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮中添加1%HWG显著提高了妊娠第107天母猪血清中天冬酰胺、组氨酸、缬氨酸和鸟氨酸含量(P<0.05)，显著降低了母猪血清中甘氨酸含量(P<0.05)；饲粮中添加2%HWG显著提高了母猪血清中天冬酰胺、组氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和鸟氨酸含量(P<0.05)，显著降低了母猪血清中甘氨酸含量(P<0.05)。

表6 妊娠后期饲粮中添加HWG对母猪血清中氨基酸含量的影响

如表7所示，与对照组相比，饲粮中添加1%HWG显著提高了脐带血清中组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量(P<0.05)；饲粮中添加2%HWG显著提高了脐带血清中精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量(P<0.05)。

2.4 妊娠后期饲粮中添加HWG对胎盘组织营养物质转运相关基因表达的影响

由图1可知，与对照组相比，饲粮中添加1%HWG显著提高了胎盘组织中氨基酸转运载体中性氨基酸转运载体2(SNAT2)、谷氨酸转运载体3(EAAT3)、L型氨基酸转运载体2(LAT2)和葡萄糖转运载体2(GLUT2)的mRNA相对表达量(P<0.05)；饲粮中添加2% HWG显著提高了胎盘组织中性氨基酸转运载体1(SNAT1)、SNAT2、EAAT3、LAT2，小肽转运载体1(PepT1)、小肽转运载体2(PepT2)和葡萄糖转运载体葡萄糖转运载体1(GLUT1)、GLUT2、葡萄糖转运载体3(GLUT3)的mRNA相对表达量(P<0.05)。

表7 妊娠后期饲粮中添加HWG对脐带血清中氨基酸的影响

3 讨 论

妊娠期间胎儿的营养物质主要决定于母体的营养状况和胎盘转运营养物质的效率[15]。在实际养猪生产中常通过限饲的方法减少母猪在妊娠期体脂过度积累，同时也在一定程度上限制了胎儿的营养物质供给和生长发育。胎儿60%的体增重均发生在妊娠后期，尤其是妊娠第90～114天，限饲对胎儿的生长发育带来的影响在这一阶段可能更为明显[16]。蛋白质营养在调节胎儿生长、发育和存活中起着重要作用[17]。蛋白质缺乏或不平衡可能引起胎儿体增重减慢，均匀度降低，增加宫内发育迟缓(IUGR)仔猪的发生率[18]。HWG是一种天然的植物源性蛋白质，富含谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和小肽。HWG对胎儿生长发育的影响目前还未见报道。本试验在妊娠后期母猪饲粮中添加HWG，探讨其对胎儿生长发育和繁殖性能的影响，研究结果发现，饲粮中添加2%HWG显著提高了仔猪初生窝重和初生活仔窝重，这与前人研究在母猪饲粮中添加谷氨酰胺提高初生活仔窝重和平均初生重，降低窝内变异系数的结果[6,19]相一致。本试验检测了母猪和脐带血清中游离氨基酸，结果发现饲粮中添加1%和2%HWG显著提高了母猪血清中天冬氨酸、组氨酸和鸟氨酸含量，显著降低了甘氨酸含量；饲粮中添加1%HWG显著提高了脐带血清中组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量；饲粮中添加2%HWG显著提高了脐带血清中精氨酸、谷氨酸、谷氨酸氨、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸含量。这提示HWG添加可能通过促进氨基酸更多转运到脐带血，促进胎儿的生长发育。血清生化指标检测发现，饲粮中添加HWG对母猪血清中总蛋白、白蛋白、葡萄糖、尿素氮含量和碱性磷酸酶活性无显著影响，但显著降低了血氨含量；饲粮中添加2%HWG显著提高了脐带血清中白蛋白、葡萄糖含量和碱性磷酸酶活性，减少了血氨的生成，提示HWG提高了仔猪的营养供给和蛋白质的利用效率。这可能是HWG提高了仔猪平均初生重的原因之一[5]。

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

胎盘是母体血液中营养物质转运到胎儿的主要器官，胎盘组织中氨基酸转运载体和葡萄糖转运载体是调节胎儿营养物质供给的重要介质[20-21]。HWG可提高脐带血清中氨基酸和葡萄糖的含量[16]，本试验进一步检测了妊娠后期胎盘组织中重要的氨基酸和葡萄糖转运载体的mRNA表达量，结果发现，饲粮中添加2%HWG显著提高了母猪胎盘组织的氨基酸转运载体SNAT1、SNAT2、EAAT3、LAT2和小肽转运载体PepT1、PepT2以及葡萄糖转运载体GLUT1、GLUT2、GLUT3的mRNA表达量。葡萄糖是胎儿和胎盘的主要能量底物，氨基酸可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径促进蛋白质的合成，调节胎儿的生长发育[22]。这提示HWG可能通过调节胎盘组织中氨基酸和葡萄糖的转运，改善母体到胎儿的营养物质运输。

以上结果表明，妊娠后期母猪饲粮中添加HWG可以提高母猪血清中氨基酸含量，调节胎盘组织中氨基酸和葡萄糖转运载体的表达，从而改善胎儿营养物质供给和蛋白质利用效率，促进胎儿的生长发育，进而提高仔猪初生窝重、初生活仔窝重。我国小麦蛋白资源丰富，通过酶解工艺的优化生产优质的水解蛋白，有助于实现已有蛋白质资源高效利用，减少我国养猪业对进口大豆的依存度，促进养猪业的可持续发展。

4 结 论

母猪妊娠后期饲粮中添加HWG可提高胎盘组织中营养物质转运相关基因表达的表达，促进母体营养物质的转运效率和胎猪的生长发育，提高仔猪初生窝重和初生活仔窝重。