饲粮中添加高剂量茶多酚对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质和脂质代谢的影响

何俊金 王建萍 丁雪梅 曾秋凤 白世平 张克英

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，动物抗病营养与饲料农业部重点实验室，成都 611130)

我国是世界上最大的鸡蛋生产和消费国，鸡蛋产量约占全世界总产量的45%，且呈逐年上升的趋势。目前高产蛋鸡产蛋后期45周龄时产蛋率降到88%左右，而后产蛋率下降速度逐渐增快，80周龄时下降到60%左右。同时，长期高产蛋积累的应激导致鸡蛋品质下降，包括蛋壳质量和蛋清品质，因而如何提高鸡蛋品质特别是产蛋后期的鸡蛋品质至关重要。前人研究报道也证实氧化应激造成的繁殖性能衰退可能是蛋鸡产蛋后期和应激时产蛋性能下降的主要原因[1]。

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶叶中多酚类物质的总称，主要为儿茶素类(占60%～80%)，是茶叶中有保健功能的主要成分之一。茶多酚具有较强的抗氧化能力，研究表明其抗氧化能力是维生素C的25倍，是维生素E的80倍[2-3]。茶多酚具有抑菌、抗病、改善肠道微生物环境和降血脂等作用，可保障动物机体健康，但对蛋鸡生产性能的影响并不一致[4]。同时，有研究报道，茶多酚能够一定程度上改善鸡蛋品质，降低鸡蛋中的胆固醇含量[4]。楼洪兴等[5]等研究发现，在蛋鸡饲粮中添加250、550和1 000 mg/kg茶多酚(纯度为40%)对蛋鸡产蛋率有一定的改善作用，但随着茶多酚的添加水平的提高未见有增高趋势，添加400 mg/kg茶多酚降低46周龄蛋鸡血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量并提高高密度脂蛋白含量；张旭等[6]在蛋鸡饲粮中添加100 mg/kg茶多酚(纯度为98%)能够显著提高平均蛋重，显著降低料蛋比和蛋黄胆固醇含量；Biswas等[7]发现，饲粮添加300 mg/kg的绿茶粉使蛋鸡采食量显著下降，平均蛋重显著降低。由此可见，茶多酚对蛋鸡生产性能和蛋品质影响的报道并不一致，这可能与茶多酚添加物的纯度和添加剂量不同有关。目前茶多酚对蛋鸡脂质代谢影响的研究较少，有待进一步的揭示。因此，本试验通过考察高剂量茶多酚对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质和脂质代谢的影响，探讨提高产蛋后期蛋鸡产蛋性能和蛋品质的营养手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用茶多酚产品由四川克鲁尼茶叶生物科技有限公司提供，其纯度为63.58%，其中儿茶素含量为40.20%，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量为21.97%，咖啡碱含量为6.84%。

1.2 试验动物与饲粮

试验选用65周龄的健康罗曼粉壳蛋鸡480羽，采用单因素完全随机设计，将蛋鸡分为4组，每组8个重复，每个重复15羽。预试期2周，正试期9周。

试验用基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，在四川农业大学动物营养研究所试验基地参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)中蛋鸡营养成分推荐值配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)维生素预混料为每千克饲粮提供 Vitamin premix provided the following per kilogram of the diet:VA 8 000 IU，VD31 600 IU，VE 5 IU，VB10.8 mg，VB22.5 mg，VB61.5 mg，VB120.004 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 2.2 mg，叶酸 folic acid 0.25 mg，烟酸 nicotinic acid 20 mg，生物素 biotin 0.1 mg。2)矿物质预混料为每千克饲粮提供 Mineral premix provided the following per kilogram of the diet:Mn(MnO2) 60 mg，Zn(ZnSO4·7H2O) 80 mg，Cu(CuSO4·5H2O) 8 mg，Fe(FeSO4·7H2O) 60 mg，I(KI) 0.35 mg，Se(Na2SeO3·5H2O) 0.3 mg。3)代谢能为计算值，其他为测定值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.3 试验设计与饲养管理

将4组蛋鸡随机分为1个对照组和3个试验组，对照组蛋鸡饲喂基础饲粮，试验组蛋鸡分别饲喂在基础饲粮中添加666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚的试验饲粮。

饲养试验在四川农业大学动物营养所试验场进行。所有试验蛋鸡均采用3层阶梯式笼养，每笼3只鸡，连续的5笼为1个重复，每组8个重复。全程采用粉料饲养，光照16 h，舍内温度控制在22 ℃左右，自由饮水，每天喂食2次(09:00和15:00)，并观察鸡只有无异常行为，每天16:00拣蛋并记录称重。定期打扫圈舍卫生，并按常规程序进行鸡只免疫和圈舍消毒。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生产性能指标的测定

产蛋率、平均蛋重：正试期内每日以重复为单位记录产蛋数和产蛋重，计算产蛋率和平均蛋重。

平均日采食量：每天记录饲粮的添给与损耗情况，每周结算饲粮总采食量，计算平均日采食量。

料蛋比：根据产蛋总重和总采食量计算料蛋比。

1.4.2 蛋品质指标的测定

在试验第9周结束时每个重复采集2枚外形完好、重量接近平均蛋重的鸡蛋(16：00采集，19:00测定蛋品质)，采用蛋品质全自动测定仪(EMT-7300，日本)对蛋壳强度、蛋黄颜色和哈夫单位进行测定。小心移除蛋清后，对蛋黄重和蛋壳重进行称量，计算蛋壳比率、蛋黄比率和蛋白比率。

蛋壳比率(%)=100×蛋壳重/蛋重； 蛋黄比率(%)=100×蛋黄重/蛋重； 蛋白比率(%)=100×(蛋重-蛋黄重-蛋壳重)/蛋重。

蛋黄胆固醇含量：使用高效液相色谱法测定蛋黄胆固醇含量，具体方法参照GB/T 22220—2008。

蛋黄脂肪酸组成：使用气相色谱法测定蛋黄脂肪酸组成，具体方法参照NY/T 2068—2011。

1.4.3 血清脂质代谢指标的测定

在试验第9周结束时，每个重复随机挑选1只健康的蛋鸡，从翅静脉抽取10 mL血液，分离血清，-20 ℃保存，采用全自动生化分析仪(HITACHI7020，日本)测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。

1.4.4 肝脏脂质代谢相关基因mRNA相对表达量的测定

将采集血液后的蛋鸡颈静脉放血屠宰，分离肝脏左叶尖端1.5 g左右，装于2 mL灭菌EP管中，立即保存于液氮中，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于测定肝脏脂质代谢相关基因mRNA的相对表达量。

根据NCBI公布的脂肪酸合成酶(FAS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)和β-肌动蛋白(β-actin)的基因序列来设计引物并检测引物的特异性，以β-actin作为内参基因。引物由Invitrogen公司合成，目的基因和内参基因的引物序列见表2。

肝脏组织中RNA的提取采用两步法按说明书操作。使用SYBR®Premix Ex TaqTMKit(TaKaRa生物有限公司，日本)试剂盒进行荧光定量PCR测定。采用Applied Biosystems 7900HT Real Time PCR系统(Applied Biosystems，CA)进行PCR扩增反应，程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；熔解曲线条件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。参考Livak等[8]的方法，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量，以相对于对照组的变化倍数表示。

1.5 数据处理与分析

试验数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行组间多重比较，P≤0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡生产性能的影响

由表3可知，与对照组相比，2 666 mg/kg茶多酚组第1～3周、第4～6周和第1～9周产蛋率均显著下降(P<0.05)。与对照组相比，各茶多酚添加组的平均日采食量呈不同程度的降低，但随着试验进行，各茶多酚添加组的平均日采食量逐渐上升，与对照组的差距逐渐缩小，2 666 mg/kg茶多酚组的平均日采食量在第1～3周、第4～6周、第7～9周和第1～9周均显著低于对照组(P<0.05)，1 333 mg/kg茶多酚组的平均日采食量在第1～3周和第4～6周显著低于对照组(P<0.05)且显著高于2 666 mg/kg茶多酚组(P<0.05)，666 mg/kg茶多酚组的平均日采食量在第1～3周显著低于对照组(P<0.05)且显著高于2 666 mg/kg茶多酚组(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚组的平均蛋重在第1～3周和第1～9周显著低于对照组与666 mg/kg茶多酚组(P<0.05)，1 333和2666 mg/kg茶多酚组的平均蛋重在第4～6周显著低于对照组(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚组的料蛋比在第1～3周和第4～6显著高于其他各组(P<0.05)。

表2 引物序列

表3 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡生产性能的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P≤0.05), while with the same letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡蛋品质的影响

由表4可知，与对照组相比，饲粮中添加不同剂量的茶多酚对蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋黄比率和蛋白比率均无显著影响(P>0.05)。2 666 mg/kg茶多酚组哈夫单位在第2周显著高于对照组(P<0.05)，1 333 mg/kg茶多酚组哈夫单位在第4周显著高于其他各组(P<0.05)。2 666 mg/kg茶多酚组蛋壳比率在第2周显著低于对照组与1 333 mg/kg茶多酚组(P<0.05)，且1 333 mg/kg茶多酚组蛋壳比率在第2周也显著低于对照组(P<0.05)。

表4 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡蛋品质的影响

2.3 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡蛋黄胆固醇含量和脂肪酸组成的影响

由表5可知，与对照组相比，饲粮中添加不同剂量的茶多酚显著影响蛋黄胆固醇含量(P<0.05)，且随着茶多酚添加剂量的增加，蛋黄胆固醇含量有降低趋势。666、1 333和2666 mg/kg茶多酚组蛋黄胆固醇含量显著低于对照组(P<0.05)，且2 666 mg/kg茶多酚组蛋黄胆固醇含量还显著低于666 mg/kg茶多酚组(P<0.05)。饲粮中添加不同剂量的茶多酚对蛋黄脂肪酸组成无显著影响(P>0.05)。

表5 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡蛋黄胆固醇含量和脂肪酸组成的影响

2.4 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡血清脂质代谢指标的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮中添加不同剂量的茶多酚对蛋鸡血清高密度脂蛋白胆固醇含量无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚组血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低(P<0.05)，1 333和2 666 mg/kg茶多酚组血清甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。

表6 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡血清脂质代谢指标的影响

2.5 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

由图1可知，666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚组肝脏AMPKmRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，且2 666 mg/kg茶多酚组肝脏AMPKmRNA相对表达量还显著高于666和1 333 mg/kg茶多酚组(P<0.05)。肝脏脂质代谢其他相关基因(FAS、LDLR和VLDR)mRNA的相对表达量各组间均差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡生产性能的影响

通过对蛋鸡进行9周的茶多酚饲喂试验，结果表明，饲粮添加666 mg/kg茶多酚对蛋鸡产蛋率没有显著影响，而添加2 666 mg/kg茶多酚后蛋鸡的产蛋率显著下降。这可能与本试验发现的添加茶多酚以后降低了蛋鸡的采食量有关。这与前人研究结果并不相同，楼洪兴等[5]在饲粮中添加250、550和666 mg/kg茶多酚(纯度为40%)后发现对蛋鸡的产蛋率有一定改善作用，但随着茶多酚的添加剂量的提高未见有增高趋势。楼洪兴等[5]的试验结果与本试验结果不同的原因可能是茶多酚的来源和添加剂量的不同，本试验添加的茶多酚产品中含有一部分咖啡碱(6.84%)，而咖啡碱可能与蛋鸡采食量的降低有关，且本试验中茶多酚的添加剂量远远高于楼洪兴等[5]的试验。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)，不标注字母或标注相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

本试验中，饲粮中添加不同剂量的茶多酚均可降低蛋鸡的平均蛋重，这与相关报道相近，例如，饲粮中添加0.67%茶叶提取物略微降低平均蛋重[9]，饲粮中添加5%和10%绿茶粉显著降低蛋重[10]。除采食量降低是影响蛋重的原因外，儿茶素抑制了肠道对脂肪的吸收和脂肪酶活性，使蛋黄脂质形成受阻[9-10]，也会影响蛋重。

本试验中，各茶多酚添加组料蛋比均高于对照组，与前人研究结果不相同。王人悦[11]试验表明茶多酚显著降低料蛋比；汪小红等[12]研究发现，400 mg/kg茶多酚显著降低了试验期前4周的平均蛋重，200 mg/kg茶多酚显著降低了试验期后4周的料蛋比。上述研究结果与本试验结果不同的原因可能是茶多酚的来源和添加剂量的不同。

饲粮中添加不同剂量的茶多酚后蛋鸡平均日采食量均下降，产蛋率和平均蛋重下降及料蛋比的升高均与采食量下降有极大关系。据尹靖东等[13]报道，饲喂蛋鸡绿茶粉时，随着绿茶粉添加剂量的增加，蛋鸡的采食量也增加，这与本试验结果不相同。Biswas等[7]报道，饲粮中添加0.3%的绿茶粉(饲粮中茶多酚含量约为600 mg/kg)可使蛋鸡的采食量显著下降，本试验结果与之相似。造成结果不同的原因可能有：蛋鸡对茶多酚本身或咖啡碱的苦涩味并不适应，蛋鸡对茶多酚有一个逐渐的适应过程，在试验初期蛋鸡采食量急剧下降，之后逐渐增加；另外，茶多酚中含有的酚酸、咖啡碱及缩合单宁等抗营养因子[14]，破坏或阻碍蛋鸡对营养物质的消化吸收，造成蛋白质消化率下降，产生食欲不振[15]等症状。

3.2 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡蛋品质的影响

在试验第2周，2 666 mg/kg茶多酚组蛋壳比率显著低于对照组，这可能与本试验使用的茶多酚产品中含有部分咖啡碱(6.84%)有关。有前人研究表明，咖啡碱的摄入会导致钙的流失和骨质疏松等不良反应，可明显遏制钙在消化道中的吸收，使体内缺钙，从而影响蛋壳质量，造成蛋壳比率下降[16-17]。

饲粮中添加茶多酚能够增加鸡蛋的哈夫单位，哈夫单位能够反映蛋的新鲜程度[18]。影响鸡蛋哈夫单位的因素有贮存时间和温度以及蛋鸡年龄、应激、营养、营养素的补充、疾病等[19-20]，在环境和条件相同的情况下，营养是影响鸡蛋哈夫单位的关键因素。自由基会对蛋白质造成损伤，导致蛋白质变性或功能丧失[21]，而茶多酚具有很强的清除自由基能力，饲粮中添加茶多酚增加鸡蛋的哈夫单位的主要原因可能就与其具有抗氧化功能有关。

儿茶素可能会抑制肠道脂肪的吸收和脂肪合酶的活性，从而造成蛋黄脂质形成受阻[22]。本试验发现茶多酚对蛋黄比率无显著影响，可以推测添加茶多酚后蛋重降低并不是因为茶多酚抑制肠道脂肪的吸收和脂肪酶的活性引起的，更可能是因为茶多酚中的抗营养因子影响了蛋鸡的生产性能。

本试验中，饲粮中添加茶多酚能够降低蛋黄中胆固醇的含量，与齐广海等[23]报道的随着饲粮中茶多酚添加剂量的增加，蛋黄胆固醇含量逐渐下降的趋势一致。鸡蛋中胆固醇大部分来自母鸡肝脏合成的脂蛋白，主要是极低密度脂蛋白(VLDL)，其次是卵黄蛋白原，蛋鸡肝脏和卵巢是胆固醇生物合成的主要场所，肝脏可以高速度合成胆固醇，并且能够快速将胆固醇以脂蛋白形式运送到血液，血液中的胆固醇大部分随VLDL转入蛋黄，以产蛋的形式排出[24]。

3.3 饲粮中添加高剂量茶多酚对蛋鸡血清脂质代谢指标的影响

本试验中，饲粮中添加不同剂量的茶多酚均降低了蛋鸡血清总胆固醇、甘油三酯与低密度脂蛋白胆固醇含量，这与楼洪兴等[5]得出的在饲粮中添加0.4%茶多酚可降低46周龄蛋鸡血清胆固醇、甘油三酯与低密度脂蛋白胆固醇含量的结果相似。随着茶多酚添加剂量的增加，血清甘油三酯含量有降低趋势，说明脂肪分解增强。茶多酚降血脂作用机制可能与雌激素有关，茶多酚可通过调节雌激素、削弱雌激素维持高血脂的作用，表现出降血脂作用；此外，茶多酚能够通过抑制体内生脂酶活性和基因表达，从而抑制肝脏中脂类的合成。

3.4 饲粮中添加高剂量茶多酚对肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

肝脏在家禽的脂质代谢中起着重要的作用，是脂肪酸从头合成的主要部位[25]，占脂肪酸合成量的90%以上。动物体内脂肪组织合成与分解的调控比较复杂，主要是由脂质代谢关键酶来完成，酶蛋白的多寡和活性的高低是由关键酶基因的表达量来决定的。AMPK是维持体内能量平衡的关键物质[26]。AMPK被活化的同时使机体代谢方向朝着抑制耗能的合成代谢、促进产能的分解代谢方向进行。AMPK被活化后，可以在许多组织中对脂质代谢进行调节。在肝脏组织中，AMPK可以促进脂肪酸氧化，降低胆固醇、甘油三酯的合成，抑制脂肪酸的产生。本试验发现，与对照组相比，饲粮中添加666、1 333和2 666 mg/kg茶多酚均可以显著升高肝脏AMPKmRNA的相对表达量，对其他肝脏脂质代谢相关基因mRNA的相对表达量无显著影响。近几年的大量研究表明，AMPK基因被激活后，可以降低动物细胞及机体中脂肪酸及胆固醇的合成[27]。AMPK可以抑制固醇调节元件序列，固醇调节元件结合蛋白通过结合固醇调节元件来起到转录激活LDLR基因的表达，从而加快胆固醇的合成与代谢。AMPK在动物试验上取得了相当多的研究成果，为降低鸡蛋中胆固醇的含量提供了新的思路。根据AMPK在脂质代谢中起到的重要作用，推测茶多酚可能通过调控AMPK基因的表达进而影响蛋鸡胆固醇的代谢。

4 结 论

① 饲粮中添加高剂量(1 333和2 666 mg/kg)茶多酚会降低蛋鸡的生产性能，但可提高鸡蛋的哈夫单位，降低蛋黄胆固醇含量以及血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯含量。

② 饲粮中添加高剂量(1 333和2 666 mg/kg)茶多酚上调了蛋鸡肝脏AMPK基因的表达，对肝脏其他脂质代谢相关基因的表达没有产生显著影响。